幾種超分辨率顯微術(shù)原理及對(duì)比

1、各廠家超分辨技術(shù)1、萊卡公司采用的超分辨技術(shù)STED2000年，德國(guó)科學(xué)家 StefanHell開(kāi)發(fā)了另一種超高分辨率顯微技術(shù)， 其基本原理是通過(guò)物理過(guò)程來(lái)減少激發(fā)光的光斑大小，從而直接減少點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的半高寬來(lái)提高分辨率.當(dāng)特定的熒光分子被比激發(fā)波長(zhǎng)長(zhǎng)的激光照射時(shí)，可以被強(qiáng)行猝滅回到基準(zhǔn)態(tài).利用這個(gè)特性，Hell等開(kāi)發(fā)出了受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)(stimulatedemissiondepletion,STED).其基本的實(shí)現(xiàn)過(guò)程如圖2 所示，就是用一束激發(fā)光使熒光物質(zhì)(既可以是化學(xué)合成的染料也可以是熒 光蛋白)發(fā)光的同時(shí)，用另外的高能量脈沖激光器發(fā)射一束緊挨著的、 環(huán)型的、波長(zhǎng)較長(zhǎng)的激光將第一束

2、光斑中大部分的熒光物質(zhì)通過(guò)受激 發(fā)射損耗過(guò)程猝滅，從而減少熒光光點(diǎn)的衍射面積，顯著地提高了顯微鏡的分辨率，原理見(jiàn)下圖。漱發(fā)光光斑受澈岌射隕耗泄光光斑STED成像技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)是可以快速地觀察活細(xì)胞內(nèi)實(shí)時(shí)變化的過(guò) 程，因此在生命科學(xué)中應(yīng)用更加廣泛2、蔡司公司采用的超分辨技術(shù)PLAM2002年，Patterson禾口 Lippincott Schwartz首次利用一種綠色熒光蛋白 (GFP的變種(PAGFP來(lái)觀察特定蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡.這種熒 光蛋白PAGFP在未激活之前不發(fā)光，用405nm的激光激活一段時(shí)間后才可以觀察到488nm激光激發(fā)出來(lái)的綠色熒光.德國(guó)科學(xué)家EricBetzig敏銳地

3、認(rèn)識(shí)到，應(yīng)用單分子熒光成像的定位精度，結(jié)合這 種熒光蛋白的發(fā)光特性，可以來(lái)突破光學(xué)分辨率的極限.2006年9月，Betzig和Lippincott Schwartz等首次在 Scienee上提出了光激活定 位顯微技術(shù)(photoactivatedlocalizationmicroscopy,PALM)的概念.其基 本原理是用 PA GFP來(lái)標(biāo)記蛋白質(zhì)，通過(guò)調(diào)節(jié)405nm激光器的能量，低能量照射細(xì)胞表面， 一次僅激活出視野下稀疏分布的幾個(gè)熒光分子， 然后用488nm激光照射，通過(guò)高斯擬合來(lái)精確定位這些熒光單分 子.在確定這些分子的位置后，再長(zhǎng)時(shí)間使用488nm激光照射來(lái)漂白這些已經(jīng)定位正確的熒光

4、分子，使它們不能夠被下一輪的激光再激活出來(lái).之后，分別用 405nm和488nm激光來(lái)激活和漂白其他的熒 光分子，進(jìn)入下一次循環(huán).這個(gè)循環(huán)持續(xù)上百次后，我們將得到細(xì)胞 內(nèi)所有熒光分子的精確定位.將這些分子的圖像合成到一張圖上，最后得到了一種比傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡至少高10倍以上分辨率的顯微技術(shù)，原理如下：PLAM通過(guò)定位細(xì)微結(jié)構(gòu)乃至單分子，實(shí)現(xiàn) 20 nm的橫向分辨率和50 nm軸向分辨率。大鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞線粒體3、尼康公司采用的超分辨技術(shù)STROM和SIMSTROM:2006年底，美國(guó)霍華德休斯研究所的華裔科學(xué)家莊曉薇實(shí)驗(yàn)組開(kāi)發(fā) 出來(lái)一種類似于 PALM的方法，可以用來(lái)研究細(xì)胞內(nèi)源蛋白的超分辨 率

5、定位.他們發(fā)現(xiàn)，不同的波長(zhǎng)可以控制化學(xué)熒光分子Cy5在熒光激發(fā)態(tài)和暗態(tài)之間切換，例如紅色561 nm的激光可以激活 Cy5發(fā)射熒光，同時(shí)長(zhǎng)時(shí)間照射可以將 Cy5分子轉(zhuǎn)換成暗態(tài)不發(fā)光.之后，用綠 色的488nm激光照射Cy5分子時(shí)，可以將其從暗態(tài)轉(zhuǎn)換成熒光態(tài)， 而此過(guò)程的長(zhǎng)短依賴于第二個(gè)熒光分子Cy3與Cy5之間的距離.因此，當(dāng)Cy3和Cy5交聯(lián)成分子對(duì)時(shí)，具備了特定的激發(fā)光轉(zhuǎn)換熒光分子發(fā) 射波長(zhǎng)的特性.將Cy3和Cy5分子對(duì)膠聯(lián)到特異的蛋白質(zhì)抗體上，就可以用抗體來(lái)標(biāo)記細(xì)胞的內(nèi)源蛋白.應(yīng)用特定波長(zhǎng)的激光來(lái)激活探針，然后應(yīng)用另一個(gè)波長(zhǎng)激光來(lái)觀察、精確定位以及漂白熒光分子，此過(guò)程循環(huán)上百次后就可以得

6、到最后的內(nèi)源蛋白的高分辨率影像，被他們命名為隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微技術(shù)(stochasticopticalreconstructionmicroscopy,STORM) . 2007 年，他們進(jìn)一步改進(jìn)STORM技術(shù)，發(fā)展了不同顏色的變色熒光分子對(duì)，可以同時(shí)記錄兩種甚至多種蛋白質(zhì)的空間相對(duì)定位，從而闡明籠形蛋白clathrin形成的內(nèi)吞小泡與細(xì)胞骨架蛋白之間的精確空間位置關(guān)系,兩種顏色的分辨率都可以達(dá)到2030nm,原理如下圖：5RP1 IrctivatK allSTEP 2 AlexaM?已 randomby irradiating CyZ lointensrty tightSTEP 3 Exci

7、te Alexa&47 with strong light and capture imjgM of localizabpnRepeatSTORM通過(guò)一對(duì)染料對(duì)通過(guò)隨機(jī)發(fā)光空間定位，實(shí)現(xiàn)了XY20nm分辨率SIM:改變光學(xué)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)來(lái)突破光學(xué)極限的另一個(gè)方法是利用飽和結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)(saturatedstructureilluminationmicroscopy,SSIM).早在1963年，Lukosz和Marchand就提出了特定模式側(cè)向入射的光線可以 用來(lái)增強(qiáng)顯微鏡分辨率的理論2005年，加州大學(xué)舊金山分校的Gustafsson博士首先將非線性結(jié)構(gòu)性光學(xué)照明部件引入到傳統(tǒng)的顯微

8、 鏡上，得到了分辨率達(dá)到 50nm的圖像.SSIM技術(shù)的原理是將多重相 互衍射的光束照射到樣本上，然后從收集到的發(fā)射光模式中提取高分 辨率的信息如圖所示F壇-3 L$a.ng mdarof light diffrftaon 粉th電 bptkaJ用3通過(guò)衍射的聲阿干涉效陋燉傍提藝井濟(jì)聿當(dāng)一嚇未揶結(jié)構(gòu)的物協(xié)何磧一牛結(jié)糊W則的聘射櫃式舊的光斷孵嗣川 合產(chǎn)生云紋來(lái)紋訶血陰©一云址棗紋規(guī)生在來(lái)徉物除的空間 頻皐與粥財(cái)光絨的空間呉韋肓差異的地方.顯而爲(wèi)見(jiàn)在顯誡備下旨捋艱聽(tīng)，敕可収暑到它啟大了原先不配場(chǎng)井蒂固來(lái)的祥車紙枸.通過(guò) 計(jì)韋機(jī)避一步分折斯芮殺奴中包含的僮寶可吐匾組出樣京的育分鏘至因慘心SIM通過(guò)結(jié)構(gòu)照明莫爾紋原理實(shí)現(xiàn)了任何熒光染料都可以達(dá)到XY100nm .EMCCD拍攝SIM拍攝4、奧林巴斯公司采用的 OSR技術(shù)圖像超分辨率重構(gòu)(super resolution,SR)是指利用計(jì)算機(jī)將一幅低分辨率圖像(low resolutionLR)或圖像序列進(jìn)行處理，恢復(fù)出高 分辨率圖像(high resolution ，HR)的一種圖像處理技術(shù)。奧林巴斯 超分辨技術(shù)通過(guò)高倍 60X或者100X油鏡通過(guò)縮小共聚焦上的針 孔用強(qiáng)激光將樣品掃描 2050次后通過(guò)軟件進(jìn)行運(yùn)算重構(gòu)，此技 術(shù)存在一定的局