細胞毒性試驗總結

1、（一）實驗前應明確的問題1。選擇適當?shù)募毎臃N濃度。一般情況下，96孔培養(yǎng)板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進行MTT試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數(shù)條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數(shù)和培養(yǎng)時間，以保證培養(yǎng)終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT結晶形成酌量與細胞數(shù)呈的線性關系。否則細胞數(shù)太多敏感性降低，太少觀察不到差異2。藥物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結果再定個比較大的范圍先初篩。根據(jù)自己初篩的結果縮小濃度和時間范圍再細篩.切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。3 .時間點的

2、設定。在不同時間點的測定OD值，車入excel表，最后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點應該就 是最好的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯）4 .培養(yǎng)時間。200ul的培養(yǎng)液對于10的45次方的增殖期細胞來說，很難維持 68h,如果 營養(yǎng)不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向 G0期而趨于靜止，影響結果，我們是在 48h換液 的。5。MTT法只能測定細胞相數(shù)和相對活力，不能測定細胞名對數(shù)。做 MTT時，盡量無菌操作,因為細菌也可以導致 MTT比色OD值的升高。6.理論未必都是對的.要根據(jù)自己的實際情況調整。7。實驗時應設置調零孔

3、，對照孔，加藥孔.調零孔加培養(yǎng)基、 MTT、二甲基亞碉。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞碉，不同的是對照孔加溶解藥物的介質，而加藥組加入不同濃度的藥物.8。避免血清干擾。用含 15%胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞時，高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于10%胎牛血清的培養(yǎng)液進行。在呈色后，盡量吸凈培養(yǎng)孔內殘余培養(yǎng)液。（二）實驗步驟貼壁細胞：1.收集對數(shù)期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無菌 PBS填充）。2。5%CO2, 37c孵育，至細胞單層鋪滿孔底 （96孔平底板）

4、，加入濃度梯度的藥物， 原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般57個梯度，每孔100ul,設35個復孔.建議設5個，否則難以反應真實情況。3.5%CQ,37c孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。4.每孔加入20U1MTT溶液（5mg/ml ,即0.5% MTT）,繼續(xù)培養(yǎng) 4h。若藥物與 MTT能夠反應， 可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內培養(yǎng)液.6。每孔加入150ul二甲基亞碉，置搖床上低速振蕩10min,使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值

5、。7.同時設置調零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞碉），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養(yǎng)液、 MTT、二甲基亞碉）懸浮細胞：1）收集對數(shù)期細胞，調節(jié)細胞懸液濃度1X 106/ml,按次序將補足的1640 （無血清）培養(yǎng)基40ul ;加Actinomycin D （有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋lug/ml ,需預試尋找最佳稀釋度， 1:10-1:20）;需檢測物10ul;細胞懸液50ul （即5X104cell/孔），共100ul加入到96孔板 （邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加 100ul （儲存液100 1640）。2）置37C, 5%CO2孵育16-48小時,倒置顯微鏡下觀察。3

6、）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml ,即0。5%MTT）,繼續(xù)培養(yǎng)4 h.（懸浮細胞推薦使用 WST-1, 培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4）,直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm （ 630nm校準）測量各孔的吸光值）4）離心（1000轉x10min）,小心吸掉上清，每孔加入 100 ul二甲基亞碉，置搖床上低速振 蕩10 min,使結晶物充分溶解.在酶聯(lián)免疫檢測儀 OD570nm（630nm校準）測量各孔白吸光值.5）同時設置調零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞碉），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、 培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞碉）,每組設定3復孔。（三）MT硒配制MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配，

7、過濾后4c避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml保存在一20度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把 MTT粉分裝在EP管里，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了 . MTT有致癌性，用的時候小心， 有條件最好帶那種透明的簿膜手套。 配成的MTT需要無菌，MTT對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉制MTT時用用PBS溶解，也有人用生理鹽水配 ，60C水浴助溶。PBS配方：Nacl 8g,Kcl 0。 2g, NazH

8、PQ 1。 44g, KH2PO4 0。 24g,調 ph 7。 4,定容 1L.（四）關于細胞的接種（鋪板）細胞過了 30代以后就不要用了，因為狀態(tài)不好了；培養(yǎng)板要用好的（最好進口板 ，不 好的板或重復利用的板只可做預實驗.接種時最好按照預實驗摸索出的密度接種，因為細胞密度在10000/ml左右時，所測得的OD值的區(qū)間即細胞抑制率（或者增值率）的所呈現(xiàn)的線 性關系最好，結果最可信。如果鋪的太稀細胞的殺傷不會很明顯，太密細胞可能都會凋亡， 因為細胞長的太快營養(yǎng)會不夠，最后導致死亡。且而細胞過密或者過少，增殖都會過快或者過慢，其增值率線性關系不佳。故而MTT細胞密度多采用10000/ml,100

9、ul/孔。細胞密度要根據(jù)不同細胞的特點來定。如果你做的藥品對細胞具有刺激作用那么取小點的細胞濃度，如果你做的藥品對細胞具有抑制作用那么取大點的細胞濃度，這樣與對照的區(qū)別更明顯，數(shù)據(jù)更好.懸浮細胞每孔的細胞數(shù)可達到105,貼壁細胞可為103104.（五）加入MTT個人認為MTT最關鍵的是你的細胞數(shù)目和彳加入真正起作用的的MTT的適當比例，具體細胞數(shù)目和真正起作用的的MTT之間的關系確實不好確定，我認為MTT多加一些比少加好一些MTT的量各家報道不同，一般是過量的，所以 10ul即夠了。如果不使用 96孔板，培 養(yǎng)基超過100ul,MTT按口10%的比例加入.加入MTT以后振蕩一下讓 MTT與培養(yǎng)

10、基混勻， 不過這個應該關系不大.如加入MTT后都有個別孔立即變?yōu)樗{黑色，則污染的可能性趣大，另外MTT稀釋彳麥加入 細胞前逮是需要以謾濾的方式滋菌卷宜.且在加MTT前可以先在鏡下觀察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是臨近的.因為血清中白蛋白對大部分的藥物都有結合效應，所以可以單獨將藥物和MTT加在一起，看會不會起反應。如果不起反應，就不用去除含藥物的培液，直 接加MTT即可。首先說說我的一點經驗：1。吹打時懸液總量不能太多，達到吸管吸液量的 3到4倍，可能比較容易混勻。10ml的離心管里面最好裝34ml的懸液：懸液太少容易吹起很多氣泡，懸液太多又不容易吹成單細 胞懸液。2 .吸管的吸液量最好在

11、1ml左右：吸液量過多的話，一下吸起很多液體，管中所剩就很少，這樣吹打容易起泡，吸液量過少，吹打的力度就不夠，吹打就會不均勻。如果是吸液量1ml多的吸管，總液量在5ml左右為益3 .吸的時候要在懸液底部，然后提起來一點，但是吹下去的時候不要離開液面，否則容易 吹打出氣泡.4。吹打次數(shù)100左右，就可以吹打均勻了（有人認為加細胞前吹打30-50次基本就差不多均勻了 .加細胞的時候每接種 2孔反復吹打3次，每吹打3次后槍頭垂懸與細胞懸液中5秒鐘，然后再以一定的速度吸取懸液.）5。向每孔中用槍頭加入細胞時不要太快，否則你會發(fā)現(xiàn)細胞在加入的瞬間會由于槍頭的沖力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周

12、邊很少，這種不均勻的分散會產生接觸抑 制，影響細胞的生長。所以速度不能太快也不能太慢。我習慣每塊板加完后平握手中，向左3下，向右3下,在往返回復3下移動，目的是使得細胞能分散的均勻些。（鋪板技術是MTT實驗的關鍵，也是基礎，一定要練好。曾經有同學用漩渦振蕩器混勻細胞，最后細胞全死了，建議不要采用這種方法混勻細胞.其它的聲音：1.首先細胞的接種密度一定不能過大，一般每孔1000個左右就夠了，我認為寧少勿多。尤其是對于腫瘤細胞。10000/孔是太高了，這樣即使藥物有作用， MTT方法也是表現(xiàn)不出的，最佳點板濃度在4000-5000/孔，太少的話SD值會很大。2。MTT本身就是比較粗的實驗，增殖率10%左右的波動都不算奇怪。特別是新手，20%的波動也是常見的，所以很可能是技術原因引起的，特別是種板技術一定要過關。3.我做的是腫瘤細胞的 MTT實驗，這種細胞長的很快一開始我是用 100000/ML的濃度來接 種的，結果細胞長的太滿結果是沒有梯度也沒有線性關系。后來調整濃度，用過4000080000/ML的濃度都做過 MTT實驗，結果發(fā)現(xiàn)做的結果比較好點的是6000070000/ML的濃度組的。用40000/M的濃度的組，由于細胞少，藥物作用的梯度