菌種的分離與純化

1、接種、分離純化和培養(yǎng)技術(shù)一、接種將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做接種。1、接種工具和方法在實(shí)驗(yàn)室或工廠實(shí)踐中，用得最多的接種工具是接種環(huán)、 接種針。由于接種要求或方法的不同，接種針的 針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。有時滴管、吸管也可作為接種工具進(jìn)行液體接種。在固體培 養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時，需要用到涂布棒。（圖3 - 3 ）圖3 3 接種和分離工具1 .接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀常用的接種方法有以下幾種：1）劃線接種 這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基表面作來回直線形的移動， 就可達(dá)到接種的作用

2、。 常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接種和平板劃線中就常用此法。2）三點(diǎn)接種在研究霉菌形態(tài)時常用此法。此法即把少量的微生物接種在平板表面上，成等邊三角形的 三點(diǎn)，讓它各自獨(dú)立形成菌落后，來觀察、研究它們的形態(tài)。除三點(diǎn)外，也有一點(diǎn)或多點(diǎn)進(jìn)行接種的。3）穿刺接種在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力時常采用此法。做穿刺接種時，用的接種工具是接種 針。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。 它的做法是：用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作 直線穿刺，如某細(xì)菌具有鞭毛而能運(yùn)動，則在穿刺線周圍能夠生長。4）澆混接種該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒入冷卻至45 C左右的固體培養(yǎng)基，迅速

3、 輕輕搖勻，這樣菌液就達(dá)到稀釋的目的。待平板凝固之后，置合適溫度下培養(yǎng)，就可長出單個的微生物菌落。5）涂布接種與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再將菌液倒入平板上面，迅速用 涂布棒在表面作來回左右的涂布，讓菌液均勻分布，就可長出單個的微生物的菌落。6）液體接種 從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中，或者從液體培養(yǎng)物中，用移液管將菌液接 至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固體培養(yǎng)基中，都可稱為液體接種。7）注射接種該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)，如人或其它動物中，常見的疫 苗預(yù)防接種，就是用注射接種，接入人體，來預(yù)防某些疾病。8）活體接種 活體接種

4、是專門用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法，因?yàn)椴《颈仨毥臃N于活的生物體內(nèi)才能生長繁殖。所用的活體可以是整個動物；也可以是某個離體活組織，例如猴腎等；也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。2、無菌操作培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌 苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個過程叫做無菌接種操作。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無菌操作。實(shí)驗(yàn)臺面不論是什么材料，一律要求光滑、水平。光滑是便于用消毒劑擦洗；水平是倒瓊脂培養(yǎng)基時利于 培養(yǎng)皿內(nèi)平板的厚度保持一致。在實(shí)驗(yàn)臺上方，空氣流動應(yīng)緩慢，雜菌應(yīng)盡量減少，其周圍雜菌也應(yīng)越少越好。

5、為此，必須清掃室內(nèi)，關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室的門窗，并用消毒劑進(jìn)行空氣消毒處理，盡可能地減少雜菌的數(shù)量?？諝庵械碾s菌在氣流小的情況下， 隨著灰塵落下，所以接種時，打開培養(yǎng)皿的時間應(yīng)盡量短。用于接種的 器具必須經(jīng)干熱或火焰等滅菌。 接種環(huán)的火焰滅菌方法：通常接種環(huán)在火焰上充分燒紅（接種柄，一邊轉(zhuǎn)動一 邊慢慢地來回通過火焰三次），冷卻，先接觸一下培養(yǎng)基，待接種環(huán)冷卻到室溫后，方可用它來挑取含菌材料 或菌體，迅速地接種到新的培養(yǎng)基上。（圖3-4）然后，將接種環(huán)從柄部至環(huán)端逐漸通過火焰滅菌，復(fù)原。不要直接燒環(huán)，以免殘留在接種環(huán)上的菌體爆濺而污染空間。 平板接種時，通常把平板的面傾斜，把培養(yǎng)皿的 蓋打開一小部分進(jìn)行接

6、種。在向培養(yǎng)皿內(nèi)倒培養(yǎng)基或接種時， 試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊， 試管或瓶口 應(yīng)傾斜一下在火焰上通過。4圖3 4斜面接種時的無菌操作（1）接種滅菌（2）開啟棉塞（3）管口滅菌（4）挑起菌苔（5）接種（6）塞好棉塞二、分離純化含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（ Mixed culture ）。如果在一個菌落中所有細(xì)胞均來自于 一個親代細(xì)胞，那么這個菌落稱為純培養(yǎng)（Pure culture ）。在進(jìn)行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為 純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化，方法有許多種。1、傾注平板法首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在 4050

7、76;左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 充分混合，然后把這混合液傾注到無菌的培養(yǎng)皿中，待凝固之后，把這平板倒置在包箱中培養(yǎng)。單一細(xì)胞經(jīng)過 多次增殖后形成一個菌落，取單個菌落制成懸液，重復(fù)上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。（圖3 - 5 ,a）圖3 5 傾注平板法（a）涂布平板法（b）圖解1.菌懸液2.熔化的培養(yǎng)基3.培養(yǎng)物4.無菌水2、涂布平板法首先把微生物懸液通過適當(dāng)?shù)南♂專?取一定量的稀釋液放在無菌的已經(jīng)凝固的營養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個菌落。（圖3 - 5 , b）3、平板劃線法最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng)

8、物少許在平板上進(jìn)行劃線。劃線的方法 很多，常見的比較容易出現(xiàn)單個菌落的劃線方法有斜線法、 曲線法、方格法、放射法、四格法等。（圖3-6） 當(dāng)接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動時，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，最后在所劃的線上分散著單個細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng), 每一個細(xì)胞長成一個菌落。（圖3 7 ）4、富集培養(yǎng)法富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡單。我們可以創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長，在這些條件下，所需 要的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)行競爭， 在生長能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他微生物。 所創(chuàng)造的條件包括選擇最 適的碳源、能源、溫度、光、pH滲透壓和氫受體等。在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，經(jīng)過多次重復(fù)移種，最后富集的菌株很容易

9、在固體培養(yǎng)基上長出單菌落。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感 宿主細(xì)胞群體中，使其大量生長。通過多次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。1,斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法5、厭氧法在實(shí)驗(yàn)室中，為了分離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng)容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出培養(yǎng)基中的溶解氧。然后快速冷卻，并進(jìn)行接種。接種后，加入無菌的石蠟于培養(yǎng) 基表面，使培養(yǎng)基與空氣隔絕。另一種方法是，在接種后，利用N2或CO取代培養(yǎng)基中的氣體，然后在火焰上把試管口密封。有時為了更有效地分離某些厭氧菌， 可以把所分離的樣品接種于培養(yǎng)基上， 然后再把培養(yǎng)皿放 在

10、完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。二、培養(yǎng)微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營養(yǎng)物濃度、溫度、水分、 氧氣、PH等。微生物的種類不同，培養(yǎng)的方式和條件也不盡相同。1、影響微生物生長的因素微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到外界許多因素的影響。影響微生物生長的因素很多， 簡要介紹如下。1)營養(yǎng)物濃度細(xì)菌的生長率與營養(yǎng)物的濃度有關(guān)：尸以max*C/(K+C)營養(yǎng)物濃度與生長率的關(guān)系曲線是典型的雙曲線。K值是細(xì)菌生長的很基本的特性常數(shù)。它的數(shù)值很小，表明細(xì)菌所需要的營養(yǎng)濃度非常之低，所以在自然 界中，它們到處生長。然而營養(yǎng)太低時，細(xì)菌生長就會遇到困難，甚至還會

11、死亡。這是因?yàn)槌松L需要能量 以外，細(xì)菌還需要能量來維持它的生存。這種能量稱為維持能。另一方面，隨著營養(yǎng)物濃度的增加，生長率愈接近最大值。2）溫度在一定的溫度范圍內(nèi)，每種微生物都有自已的生長溫度三基點(diǎn)：最低生長溫度、最適生長溫度和最高生長溫度。在生長溫度三基點(diǎn)內(nèi)，微生物都能生長，但生長速率不一樣。微生物只有處于最適生長溫度時，生長速 度才最快，代時最短。超過最低生長溫度，微生物不會生長，溫度太低，甚至?xí)劳?。超過最高生長溫度，微 生物也要停止生長，溫度過高。也會死亡。一般情況下，每種微生物的生長溫度三基點(diǎn)是恒定的。但也常受其 它環(huán)境條件的影響而發(fā)生變化。根據(jù)微生物最適生長溫度的不同，可將它們

12、分為三個類型：a.嗜冷微生物：具是適生長溫度多數(shù)在-10 C-20C之間b.中溫微生物：其最適生長溫度一般在 20 C - 45 C之間c.嗜熱微生物：生長溫度在45c以上。3 ）水分水分是微生物進(jìn)行生長的必要條件。芽抱、抱子萌發(fā)，首先需要水分。微生物是不能脫離水而生存的。但 是微生物只能在水溶液中生長，而不能生活在純水中。各種微生物在不能生長發(fā)育的水分活性范圍內(nèi)，均具有 狹小的適當(dāng)?shù)乃只钚詤^(qū)域。4 ）氧氣按照微生物對氧氣的需要情況，可將它們分為以下五個類型。a.需氧微生物這類微生物需要氧氣供呼吸之用。沒有氧氣，便不能生長，但是高濃度的氧氣對需氧微生物也是有毒的。 很多需氧微生物不能在氧氣濃

13、度大于大氣中氧氣濃度的條件下生長。絕大多數(shù)微生物都屬于這個類型。b.兼性需氧微生物這類微生物在有氧氣存在或無氧氣存在情況下，都能生長，只不過所進(jìn)行的代謝途徑不同罷了。 在無氧氣存在的條件下，它進(jìn)行發(fā)酵作用，例如酵母菌的無氧乙醇發(fā)酵。c.微量需氧微生物這類菌是需要氧氣的，但只在 0.2大氣壓下生長最好。這可能是由一它們含有在強(qiáng)氧化條件下失活的酶， 因而只有在低壓下作用。d.耐氧微生物這類微生物在生長過程中，不需要氧氣，但也不怕氧氣存在，不會被氧氣所殺死。c.厭氧微生物這類微生物在生長過程中，不需要分子氧。分子氧存在對它們生長產(chǎn)生毒害，不是被抑制，就是被殺死。2、培養(yǎng)方法1）根據(jù)培養(yǎng)時是否需要氧氣

14、，可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)兩大類。好氧培養(yǎng)：也稱“好氣培養(yǎng)”。就是說這種微生物在培養(yǎng)時，需要有氧氣加入，否則就不能生長良好。在 實(shí)驗(yàn)室中，斜面培養(yǎng)是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。三角燒瓶液體培養(yǎng)多數(shù)是通過搖床振蕩，使外界的 空氣源源不斷地進(jìn)入瓶中。厭氧培養(yǎng)：也稱“厭氣培養(yǎng)”。這類微生物在培養(yǎng)時，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養(yǎng)過程中，最 重要的一點(diǎn)就是要除去培養(yǎng)基中的氧氣。一般可采用下列幾種方法：a.降低培養(yǎng)基中的氧化還原電位：常將還原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等，加入到培養(yǎng)基中，便可達(dá)到目 的。有的將一些動物的死的或活的組織如牛心、羊腦加入到培養(yǎng)基中，也可適合厭氧菌的生長。b.化合去氧：這也有很多方法，主要有：用焦性沒食子酸吸收氧氣；用磷吸收氧氣；用好氧菌與厭氧混合 培養(yǎng)吸收氧氣；用植物組織如發(fā)芽的種子吸收氧氣；用產(chǎn)生氫