纈沙坦對糖尿病大鼠腎臟內(nèi)皮素受體基因表達的影響

1、纈沙坦對糖尿病大鼠腎臟內(nèi)皮素受體基因表達的影響【摘要】 目的 觀察血管緊張素受體拮抗劑(ARB)纈沙坦對糖尿病大鼠腎臟內(nèi)皮素受體A（ETA）、內(nèi)皮素受體B（ETB）基因表達的影響。方法 SD大鼠,制備鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿?。―M）模型，設(shè)正常對照組、糖尿病對照組、小劑量纈沙坦治療組（10 mg· kg-1·d-1）、大劑量纈沙坦治療組（50 mg·kg-1·d-1）、極大劑量治療組（100 mg·kg-1·d-1）。9周后采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)方法觀察腎臟ETA、ETB基因表達情況。結(jié)果 與正常對照組相比，糖尿病對照組大鼠腎ETA、

2、ETB基因表達明顯升高(P<0.01)；與小劑量治療組相比，大劑量治療組上述指標(biāo)明顯改善(P<0.01)；與大劑量治療組相比，極大劑量治療組上述指標(biāo)無明顯變化。結(jié)論 纈沙坦通過降低腎內(nèi)ETA、ETB表達而達到腎臟保護作用，而且此效應(yīng)大劑量優(yōu)于小劑量。 【關(guān)鍵詞】 糖尿病 纈沙坦 內(nèi)皮素受體 基因表達 Abstract：Objective To study the effects of angiotensinreceptor antagonist valsartan on intrarenal mRNA expressions of ETA and ETB in di

3、abetic rats.Methods The experiment was carried out in one normal control group (C) and four groups of streptozotocin-induced diabetic Sprague-Dawley rats： untreated diabetic (D), low dose treated diabetic (DV10), high dose treated (DV50) and very high dose treated (DV100). The gene expression of ETA

4、 and ETB was determined by RT-PCR after 9 weeks.Results Compared to the normal control, the expressions of ETA and ETB genes were evidently increased in the diabetic rats (group D) (P<0.01). The overexpression was reduced (improved) by high-dose valsartan (P<0.01), which was much bette

5、r than what the low-dose one did, but the improvement was no further raised by increasing valsartan to the very high dose.Conclusion The renoprotective effect of valsartan of high dose is superior to that of low dose in diabetic rats. Valsartan may afford the renoprotection by decreasing the intrare

6、nal expressions of ETA and ETB mRNA. Key words： diabetic; valsartan; endothelin receptor 糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy， DN）是糖尿病的一種嚴(yán)重血管并發(fā)癥，其發(fā)病機制復(fù)雜，與諸多因素有關(guān)。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（angiotensin-converting enzyme inhibitor， ACEI）及血管緊張素受體阻斷劑（angiotensin receptor blocker, ARB）已被作為DN臨床治療一線藥物。Fujihara等1發(fā)現(xiàn),傳統(tǒng)劑量ARB不能完全阻滯腎臟過度

7、激活的腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system, RAS），從而達不到完全腎臟保護作用。目前國內(nèi)外文獻多是ARB對糖尿病腎臟內(nèi)皮素（endothelin， ET）水平影響的研究，缺乏ARB對糖尿病內(nèi)皮素受體基因表達影響的研究。本研究目的在于觀察纈沙坦對糖尿病大鼠腎臟內(nèi)皮素受體A（endothelin receptor A， ETA）、內(nèi)皮素受體B（endothelin receptor B， ETB）基因表達的影響，進一步探討ARB對糖尿病腎病的作用機制。 1 材料和方法 1.1 動物模型制備、分組及處理 雄性SD大鼠50只，7 8周齡，體重180 220 g。鏈

8、脲佐菌素（STZ） 65 mg /kg 經(jīng)腹腔注入，48 72 h 后血糖16.7 mmol/L,確認為糖尿病模型成功。造模成功后模型鼠隨機分成4組：糖尿病組（D組），8只；小劑量纈沙坦治療組（DV10組），10只，纈沙坦10 mg·kg-1·d-1，灌胃；大劑量纈沙坦治療組（DV50組），10只，纈沙坦50 mg·kg-1·d-1, 灌胃；極大劑量纈沙坦治療組（DV100組），8只，100 mg·kg-1·d-1, 灌胃。設(shè)正常對照組（C組），8只。干預(yù)治療至9周結(jié)束。動物空腹在3水合氯醛麻醉下腹主動脈插管，接XY-1型血壓監(jiān)測儀記

9、錄平均動脈壓，收集血標(biāo)本；取腎，部分腎組織液氮保存?zhèn)溆谩?1.2 實驗方法 1.2.1 血糖測定 采用羅氏血糖儀測定尾靜脈血糖。 1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR） 總RNA的提?。喝∫旱４娴哪I組織，一步法總RNA提取試劑盒提取RNA。逆轉(zhuǎn)錄：取腎組織總RNA 2 g，按常規(guī)反應(yīng)體系，于42反應(yīng)50 min，92加熱 min，滅活MMLV。PCR反應(yīng)：ETA引物，上游5-CGAGGTCATGAGGCTTTTGG-3，下游5-GTGTTTAAGCTGTTGGCGGG-3，擴增出的cDNA序列長度787 bp；ETB引物，上游5-TGCACACCTTTCCGCAAGCACG-3，下

10、游5-AGCTGGTGCCCTTCATACAGAAGGC-3，cDNA序列長度919 bp；-actin引物，上游5-CAGAAGGACTCCTACGTG-3，下游5-GCTCGGTCAGGATCTTCATG-3， cDNA序列長度442 bp。PCR反應(yīng)條件設(shè)置：ETA 94 5 min，94 30 s、53 45 s、72 45 s（36個循環(huán)），72 5 min；ETB 94 3 min，94 45 s、60 45 s、72 45 s（34個循環(huán)），72 10 min。 擴增產(chǎn)物定量分析：擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進行電泳，以凝膠成像系統(tǒng)對DNA擴增帶進行圖像分析，以ET受體/ -a

11、ctin的光密度值比值（D比值）表示ET受體基因表達水平。 1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)分析處理，計量資料采用±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析和秩和檢驗，組間兩兩比較采用q檢驗，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 2 結(jié) 果 各組糖尿病大鼠均出現(xiàn)明顯多尿、血糖升高，干預(yù)治療對這些指標(biāo)無顯著影響。與C組相比，平均動脈壓、ETA、ETB表達在D組、DV10組增高（P<0.01）；與DV10組相比，上述指標(biāo)在DV50組下降(P<0.01)；與DV50組相比，DV100組平均動脈壓降低，其余指標(biāo)無明顯改變（P&a

12、mp;gt;0.05）。具體見表1、圖1。表1 各組大鼠觀察指標(biāo)比較 3 討 論 DN是引起糖尿病患者死亡的主要原因之一。由胰島素代謝障礙而導(dǎo)致的長期高血糖是DN發(fā)生的最關(guān)鍵原因，眾多生長因子、細胞因子被激活則是病變形成的直接機制2,尤其是血管緊張素（angiotensin , Ang）與ET，它們在各種腎臟疾病包括DN 中起著重要病理作用。我們發(fā)現(xiàn)，纈沙坦治療后不僅糖尿病大鼠腎組織Ang含量下降，ET的含量亦下降，提示纈沙坦可能通過減少腎組織Ang的生成來降低ET的含量3。 既往研究多偏重于ARB對腎臟疾病腎組織中ET含量影響，對于其受體表達影響研究較少。ET受體至少可分為2種亞型，即ETA

13、、 ETB受體。ETA受體廣泛分布于血管平滑肌細胞，產(chǎn)生血管收縮。ETB受體分布于血管內(nèi)皮細胞，通過一氧化氮和前列環(huán)素的釋放，產(chǎn)生血管舒張作用；同時ETB受體也分布于血管平滑肌細胞，又可導(dǎo)致血管收縮。因而對于ETB在腎臟中作用尚有爭議：ETB可以產(chǎn)生血管舒張作用，并且分布于腎小管上皮細胞上的ETB還可促進尿鈉排泄4，因此ETB阻斷后可能加重腎臟損害；但是，由于分布于血管平滑肌細胞的ETB也產(chǎn)生血管收縮作用，而且介導(dǎo)腎小管上皮細胞增生5，因而有學(xué)者認為，ETB阻斷后可產(chǎn)生腎臟保護作用。Suga等6發(fā)現(xiàn)，在低鉀血癥大鼠模型中，選擇性ETB阻斷劑可以產(chǎn)生明確的腎臟保護作用，并且和選擇性ETA阻斷劑產(chǎn)

14、生同樣的降尿蛋白效果，這是因為ETB阻斷劑可以通過抑制ET-1/ETA（配體/受體）通路而產(chǎn)生腎臟保護作用。 在DN發(fā)病機制中，目前認為氧化應(yīng)激是重要的共同機制，Ang能上調(diào)NADPH氧化酶的作用，其產(chǎn)物過氧化陰離子O-2與NO相互作用生成ONOO-，在DN腎損傷中起到重要作用，可導(dǎo)致腎小管基底膜增厚及間質(zhì)纖維化7；而ETB受體分布于血管內(nèi)皮細胞，可使一氧化氮釋放，進而與過氧化陰離子O-2相互作用生成ONOO-造成腎損傷。 本試驗中糖尿病大鼠腎臟ETA、ETB基因表達與正常大鼠相比明顯增強，纈沙坦可降低糖尿病大鼠腎臟ETA、ETB基因表達，這可能為ARB保護腎臟的另一個重要作用機制；而且不同劑

15、量纈沙坦對糖尿病大鼠腎臟ETA及ETB基因表達影響不同,小劑量雖有一定療效，但效果不如大劑量明顯，劑量增至極大劑量，雖然平均動脈壓進一步降低，但與大劑量相比效果無明顯改善。 綜上所述，纈沙坦可能通過降低腎內(nèi)ETA、ETB表達而達到腎臟保護作用，而且此作用大劑量優(yōu)于小劑量，但劑量增至一定程度后，效應(yīng)不再增加。 【參考文獻】 1 Fujihara CK， Velho M， Malheiros DM， et al An extremely high dose of losartan affords superior renoprotection in the remnant model. Kidne

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