血管抑素蛋白質(zhì)真核胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

1、血管抑素蛋白質(zhì)真核胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 作者：張利芳 張亞瓊 邢少姬 韓麗紅【摘要】 目的：克隆人血管抑素K1-3基因，構(gòu)建重組酵母胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒PHIL-D2/K1-3。方法：從胎兒肝臟組織用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(RT-PCR)擴(kuò)增人血管抑素K1-3目的基因，克隆至酵母胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒PHIL-D2中，線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115菌株，用Sourthern雜交篩選獲得陽性重組轉(zhuǎn)化子。結(jié)果：用RT-PCR方法成功擴(kuò)增到750 bp大小的人血管抑素K1-3基因片段，并正向插入畢赤酵母染色體基因組。結(jié)論：人血管抑素K1-3基因成功整合到畢赤酵母GS115基因組。 【關(guān)鍵詞】 人血管抑素K1-3;P

2、HIL-D2;畢赤酵母GS115血管抑素是目前腫瘤研究的熱點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)它能特異性抑制腫瘤新生血管的形成，因而能夠強(qiáng)烈抑制腫瘤1，在臨床有良好的應(yīng)用前景。天然血管抑素來源有限，利用基因工程技術(shù)將血管抑素基因克隆獲得重組蛋白有重要意義。本文成功從胎兒肝臟組織用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(RT-PCR)擴(kuò)增了人血管抑素基因的有效片段，并構(gòu)建了重組表達(dá)載體，為下一步血管抑素在畢赤酵母胞內(nèi)的表達(dá)創(chuàng)造了條件。1 材料與方法1.1 主要試劑 限制性內(nèi)切酶、PMD18-T載體、T4 DNA連接酶、PCR試劑盒均購于寶生物工程(大連)有限公司;逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA抽提試劑盒、凝膠回收試劑盒購于Promegra公司;酵

3、母轉(zhuǎn)化試劑盒購于Invitrogen公司。1.2 質(zhì)粒、菌株和細(xì)胞 大腸桿菌DH-5菌株、Pichia pastoris GS115菌株、PHIL-D2真核表達(dá)質(zhì)粒均由長春生物制品研究所生物技術(shù)室提供。1.3 人血管抑素引物 北京三博生物技術(shù)公司合成。P1:5CCGAATTCATGTGCAAGACTGGGAATGGAAAG 3P2:5TTGAATTCTTAACAGGACGGTATCTTACA 31.4 人血管抑素K1-3基因片段的擴(kuò)增 以1 mL TRIzol試劑提取胎兒肝臟(約30 mg)的總RNA，以其為模板，利用設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR參數(shù)為:94 30 s，55 30 s，72

4、90 s共30個(gè)循環(huán),結(jié)束后，72 繼續(xù)延伸10 min，然后置瓊脂糖(1 %)凝膠電泳，并回收PCR產(chǎn)物。1.5 pMD18-T/K1-3質(zhì)粒構(gòu)建 將擴(kuò)增產(chǎn)物K1-3基因片段克隆入載體pMD18-T，用EcoR與Hind雙酶切鑒定，并測序。1.6 PHIL-D2/K1-3質(zhì)粒構(gòu)建 pMD18-T/K1-3與PHIL-D2同時(shí)用EcoR限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，產(chǎn)生共有的粘性末端，再用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建表達(dá)載體PHIL-D2/K1-3。用Sac(PHIL-D2載體上距EcoRI酶切位點(diǎn)735 bp處)和Pst(K1-3基因片段5端150bp處)雙酶切鑒定正反連接。1.7 重組酵母轉(zhuǎn)化子的

5、篩選 將K1-3/PHIL-D2重組質(zhì)粒用Not線性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母(GS115菌株)中，用Southern雜交法篩選出陽性重組酵母轉(zhuǎn)化子,以原始GS115菌株和轉(zhuǎn)化了空白PHIL-D2質(zhì)粒的GS115菌株為空白對照。2 結(jié)果2.1 pMD18-T/K1-3質(zhì)粒構(gòu)建 設(shè)計(jì)特異引物用RT-PCR方法從胎兒肝臟擴(kuò)增人血管抑素K1-3目的基因，克隆入pMD18-T，用EcoR和Hind雙酶切鑒定得到預(yù)期750 bp大小的特異性條帶，見圖1。經(jīng)DNA測序，此基因片段與發(fā)表的人血管抑素cDNA序列完全一致。pMD18-T/K1-3質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.2 PHIL-D2/K1-3質(zhì)粒構(gòu)建 用Sac和Pst雙

6、酶切K1-3/PHIL-D2重組表達(dá)質(zhì)粒，出現(xiàn)小于1 000 bp的目的帶(若反接將出現(xiàn)大于1 000 bp的帶)，與預(yù)期結(jié)果相符，見圖2。表明K1-3基因片段正向克隆入PHIL-D2，PHIL-D2/K1-3質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.3 重組酵母轉(zhuǎn)化子的篩選 將PHIL-D2/K1-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115，重組子將發(fā)生K1-3與酵母組DNA整合。提取轉(zhuǎn)化后畢赤酵母的DNA，標(biāo)記上述RT-PCR擴(kuò)增的K1-3基因?yàn)樘结?，用Southern雜交法篩選陽性克隆。結(jié)果有部分菌株陽性斑點(diǎn)，說明有K1-3基因的整合，篩選出陽性重組轉(zhuǎn)化子，見圖3。對照未顯色。3 討論研究表明，血管抑素是血漿纖溶酶原的內(nèi)部

7、裂解片段。纖溶酶原有5個(gè)三環(huán)結(jié)構(gòu)域，稱做Kringle區(qū)。血管抑素則具有前4個(gè)Kringle區(qū)和部分的Kringle 5區(qū)。研究證實(shí)，起抑制血管生成作用的結(jié)構(gòu)可能主要是Kringle區(qū)，并且不同的Kringle區(qū)所起的作用也不同。Kringle 1-3區(qū)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用，與血管抑素基本相同。Kringle 1-3是血管抑素的有效片段1-4，所以本課題選擇該片段克隆，為以后對表達(dá)蛋白的生物活性的測定奠定基礎(chǔ)。本課題選擇的是二代甲醇畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，有以下優(yōu)勢：(1)高效表達(dá)：具有受甲醇誘導(dǎo)的醇氧化酶(AOXI)啟動子，在轉(zhuǎn)錄水平可嚴(yán)格控制外源基因的高效表達(dá);(2)高表達(dá)量：由于畢赤酵母生長快

8、，能夠達(dá)到很高的細(xì)胞濃度，加上強(qiáng)的AOXI基因啟動子，表達(dá)外源蛋白產(chǎn)量一般較高;(3)可對表達(dá)蛋白進(jìn)行類似哺乳動物細(xì)胞的加工折疊和翻譯后修飾，如磷酸化、糖基化、二硫鍵形成等等，從而使表達(dá)的蛋白具有生物活性;(4)高穩(wěn)定性：外源基因通過質(zhì)粒整合到巴斯德畢赤酵母基因組上，隨染色體一起復(fù)制和遺傳，不會發(fā)生外源基因的丟失。目前在國內(nèi)外還沒有在畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)的文獻(xiàn)報(bào)道。在畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)有幾點(diǎn)優(yōu)勢：表達(dá)量相對胞外較高，對培養(yǎng)基及發(fā)酵條件要求不高，不易造成蛋白質(zhì)的降解，更容易實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵表達(dá)目的蛋白等5。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康木褪且芯咳搜芤炙豄1-3在畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)的情況，以為血管抑素的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。

9、【參考文獻(xiàn)】 1 Stathakis P,Lay AJ,Fitzgwrald M,et al.Angiostatin formation involves disulfide bond reduction and proteolysis in kringles 5 of plasminJ.J Biol Chem,1999,274(13):8910-8916.2 邵秋菊,袁夢暉,徐海峰.血管生成抑制素在實(shí)體瘤治療中的研究進(jìn)展J.腫瘤防治雜志,2004,10(3):332-334.3 Ji WR,Castellino FJ,Chang Y,et al.Charaterization of kringle domains of angiostatin as antatagonists of endothelial cellmigration ,an important process in angiogenesisJ.Faseb J,1998,12(15):1731-1738.4 Ji WR,Barrientos LG,Linas M,et al.Selective inhibition by kringle 5 of human plasminogen on endothelial cell migration,an i