遺傳標(biāo)記STR基因座的高分辨電泳分型

1、遺傳標(biāo)記STR基因座的高分辨電泳分型姓名 摘要：STR（Short Tandem Repeat，短片段重復(fù)序列）廣泛存在于人類及哺乳動物的基因組中，一般由26個堿基構(gòu)成一個核心序列，核心序列串聯(lián)重復(fù)排列。人群中這些重復(fù)序列具有多態(tài)性，通過對這種多態(tài)性的檢測可以進(jìn)行STR分型。本實驗首先通過磁珠法提取人類基因組DNA，之后對3個STR基因座進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用聚丙烯酰氨凝膠電泳技術(shù)（PAGE）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離，最后PCR產(chǎn)物用EB染色后在紫外燈下觀察實驗結(jié)果并對此進(jìn)行分析。通過此次實驗，我們掌握了遺傳標(biāo)記STR基因座的高分辨電泳分型的實驗原理、實驗操作和實驗結(jié)果的觀察分析，取得了良好的實驗

2、效果。關(guān)鍵詞：STR、磁珠法、PCR擴(kuò)增、聚丙烯酰氨凝膠電泳技術(shù)（PAGE）1引言DNA指紋技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了三代。第一代DNA指紋技術(shù)利用了DNA 指紋圖譜。1984年英國萊斯特大學(xué)的遺傳學(xué)家Jefferys及其合作者首次將分離的人源小衛(wèi)星DNA用作基因探針，同人體核DNA的酶切片段雜交，獲得了由多個位點上的等位基因組成的長度不等的雜交帶圖紋，這種圖紋極少有兩個人完全相同，故稱為“DNA指紋”，意思是它同人的指紋一樣是每個人所特有的。眾多“DNA指紋”組成“DNA指紋圖譜”。第二代DNA指紋技術(shù)用PCR的方法對STR位點進(jìn)行PCR擴(kuò)增可得到不同長度DNA片段，用銀染或熒光的方法對擴(kuò)增后的DNA

3、片段檢測得到DNA指紋。第三代DNA指紋技術(shù)是用PCR的方法對SNP位點進(jìn)行PCR擴(kuò)增。STR（Short Tandem Repeat，短片段重復(fù)序列）廣泛存在于人類及哺乳動物的基因組中，具有高度多態(tài)性。它們一般由26個堿基構(gòu)成一個核心序列，核心序列串聯(lián)重復(fù)排列，重復(fù)次數(shù)大多在1060次之間，由核心序列重復(fù)數(shù)目的變化產(chǎn)生長度多態(tài)性。對于一個特定的個體，染色體上某個特定位置的重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)是固定的，而對于不同的個體在同一位置處的重復(fù)次數(shù)可能不同，這就構(gòu)成了人群中這些重復(fù)序列的多態(tài)性。由于人類基因組中這種重復(fù)序列非常多，通過對這種多態(tài)性的檢測，就可以明確區(qū)分個體與個體的不同，確定父母子的親緣關(guān)

4、系，這就是STR分型。由于STR具有分布廣泛均勻、多態(tài)性豐富、信息量大、檢測簡便等優(yōu)點，被認(rèn)為是繼限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）之后的第二代遺傳標(biāo)記，已廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜繪制、基因定位、法醫(yī)鑒定、遺傳病診斷等諸多領(lǐng)域。目前已經(jīng)有DNA分型圖譜。聯(lián)合應(yīng)用16個STR位點，其個體識別率可達(dá)0.999999999998。聯(lián)合應(yīng)用16個STR位點，其父權(quán)排除率可達(dá)0.99998。本次實驗中人類基因組DNA的提取使用磁珠法核酸純化技術(shù)。它采用了納米級磁珠微珠，這種磁珠微珠的表面標(biāo)記了一種官能團(tuán)，能同核酸發(fā)生吸附反應(yīng)。該方法快速簡捷，一般可在36分鐘內(nèi)完成。不用多次漂洗磁珠也可確?；蚪MDNA的高純度，

5、提取出的基因組DNA OD260/OD280典型的比值達(dá)1.71.9，長度可達(dá)20kb50kb，可直接用于PCR、Southern-blot和各種酶切反應(yīng)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）是體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，由變性、退火、延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點，能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍，使肉眼能直接觀察和判斷。聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺（簡稱Acr）和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺（簡稱Bis）在加速劑N,N,N,N-四甲基乙二胺（簡稱TE

6、MED）和催化劑過硫酸銨（簡稱AP）或核黃素（C17H20O6N4)的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE），用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸。核酸經(jīng)過染色才能顯示帶型，最常用的是溴化乙錠染色法。溴化乙錠（EB）是一種熒光染料，這種扁平分子可以嵌入核酸雙鏈的配對的堿基之間，與核酸形成絡(luò)合物，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。激發(fā)熒光的能量來源于兩個方面，一是核酸吸收波長為260nm的紫外線后能將能量傳送給溴化乙錠，二是結(jié)合在DNA分子中的EB本身，主要吸收波長為300nm和360

7、nm的紫外線的能量，來源于這兩方面的能量，最終激發(fā)EB發(fā)射出波長為590nm的可見光譜紅橙區(qū)的紅色熒光，發(fā)射波長為605nm。EB-DNA復(fù)合物中的EB發(fā)出的熒光，比游離的凝膠中的EB本身發(fā)出的熒光強(qiáng)大10倍，因此不需要洗凈背景就能清楚地觀察到核酸的電泳帶型。此次實驗首先通過磁珠法提取人類基因組DNA，之后對3個STR基因座進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用聚丙烯酰氨凝膠電泳技術(shù)（PAGE）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離，最后將PCR產(chǎn)物用EB染色，在紫外燈下觀察實驗結(jié)果并對此進(jìn)行分析。2材料和方法2.1 材料、試劑和器材實驗材料：人類口腔上皮細(xì)胞實驗試劑：飲用水或自來水、Buffer MACL、Buffer MC

8、L、Proteinase K、Buffer MA、MagicMag Beads、70%乙醇、TE(pH8.0)、碎冰、ddH2O、10×PCR緩沖液（含MgCl2）、2.5mmol/L dNTP、10 mol/L 引物（D1S1677-F、D1S1677-R、D4S2364-F、D4S2364-R、D10S1248-F、D10S1248-R）、1U/lTaq酶溶液、1%瓊脂（糖）、10×TBE、30%聚丙烯、APS、TEMED、電極緩沖液、6×loading buffer、20bp DNA Ladder、溴化乙錠（EB）實驗儀器：10 mL離心管、1.5 mL離心

9、管、臺式高速離心機(jī)、微量移液器、藍(lán)槍頭、黃槍頭、白槍頭、恒溫水浴鍋、磁力架、PCR管、PCR儀、marker筆、貯槽、螺絲銷釘、長玻璃板、短玻璃板、“凵”形硅橡膠框、細(xì)長頭的滴管、電泳儀、紫外燈凝膠成像儀2.2 方法2.2.1磁珠法提取人類基因組DNA（1）漱口。用10mL飲用水或自來水持續(xù)用力漱口，之后將其收集于10mL離心管中，2000 rpm離心5 min，將上清液小心用微量移液器吸除，沉淀為收集得到的口腔脫落細(xì)胞。（2）裂解。向細(xì)胞沉淀中加入400L Buffer MACL，200L Buffer MCL和20L Proteinase K，用微量移液器反復(fù)吸打，均勻懸浮起細(xì)胞沉淀。然后

10、將其轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。65水浴2030min。12000rpm離心510min，小心取出500L上清至新的離心管中。（3）結(jié)合。向樣品中加入400L Buffer MA和10LMagicMag Beads。劇烈顛倒震蕩混勻10s。在加入MagicMag Beads之前，要將MagicMag Beads充分顛倒混勻。務(wù)必將MagicMag Beads加至液面以下，并盡量將槍頭上殘留的MagicMag Beads吸打干凈。震蕩后如管口沾有少量beads，用微量移液器吸取上清液并將其沖洗至離心管內(nèi)。（4）磁吸附。將離心管至于磁力架上2 min，待MagicMag Beads全部吸至離心管壁

11、上，用微量移液器吸棄上清，然后從磁力架上取出離心管。吸棄上清時盡量吸凈，但要避免吸入Beads。（5）洗滌。加入700L70%乙醇，顛倒震蕩混勻10 s。震蕩后如管口沾有少量beads，用微量移液器吸取上清液并將其沖洗至離心管內(nèi)。將離心管置于磁力架上1 min，待MagicMag Beads全部吸至離心管壁上后，用微量移液器吸棄上清，然后從磁力架上取出離心管。吸棄上清時盡量吸凈，但要避免吸入Beads。（6）重復(fù)步驟（5）一次。（7）干燥。干燥前應(yīng)盡量吸凈上清，若出現(xiàn)液體掛壁現(xiàn)象，可將離心管短暫離心后，再次將其至于磁力架上1 min，待MagicMag Beads全部吸至離心管壁上，用微量移液

12、器吸凈上清，然后從磁力架上取出離心管。室溫開蓋干燥15 min（或者放入37的溫箱中，放入時間不得超過5min）。（8）洗脫。加入20L TE(pH8.0)，用槍頭吸打混勻，將管壁上所有Beads都懸浮于TE溶液中。65水浴10 min，間或搖勻，使DNA充分洗脫。（9）取出離心管，短暫離心，置于磁力架上1 min，用微量移液器小心吸取上清至新的離心管，即獲得基因組DNA。2.2.2 PCR擴(kuò)增人類的3個STR基因座片段（1）取3個PCR管，冰上操作，按照表一的加樣順序和加樣量，構(gòu)建3個樣品反應(yīng)體系。每個樣品反應(yīng)體系均為25L。表一PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建加樣順序成分體積（L）1ddH2O1621

13、0×PCR緩沖液（含MgCl2）2.532.5mmol/L dNTP1410 mol/L 引物11510 mol/L 引物2161U/lTaq酶溶液0.57DNA樣品3合計25（2）以上成分加好后，蓋上PCR管管蓋，在管壁和管蓋上做好標(biāo)記。將PCR管稍稍離心集液于管底，之后進(jìn)行PCR反應(yīng)。（3）按照表二中所示的PCR反應(yīng)中各項目所需的溫度和時間進(jìn)行PCR反應(yīng)。1循環(huán)35次表二 PCR各項目所需的溫度和時間項目溫度時間預(yù)變性9411min變性941 min復(fù)性59.41min延伸722min終延伸6030min保存102.2.3 用聚丙烯酰氨凝膠電泳技術(shù)（PAGE）對3個STR基因座P

14、CR產(chǎn)物進(jìn)行分離（1）安裝夾心式垂直板電泳槽。裝上貯槽和固定螺絲銷釘，仰放在桌面上。將長、短玻璃板分別插到“凵”形硅橡膠框的凹形槽中，勿用手接觸灌膠面的玻璃。將已插好玻璃板的凝膠模平放在上貯槽上，短玻璃板應(yīng)面對上貯槽。將下貯槽的銷孔對準(zhǔn)已裝好螺絲銷釘?shù)纳腺A槽，雙手以對角線的方式旋緊螺絲帽。豎直電泳槽。在長玻璃板下端與硅膠模框交界的縫隙內(nèi)加入已融化的1%瓊脂（糖）。凝固后的瓊脂（糖）中應(yīng)避免有氣泡。（2）制膠。配制36mL8%的PAGE凝膠，其標(biāo)準(zhǔn)配方如表三所示。表三8%的PAGE凝膠標(biāo)準(zhǔn)配方成分體積ddH2O22.8mL10×TBE3.6 mL30%聚丙烯9.6mLAPS200

15、81;LTEMED40µL（3）制備1mm凝膠板。將混合后的分離膠溶液，用細(xì)長頭的滴管加至長、短玻璃板間的窄縫內(nèi)，距短玻璃上緣0.5 cm處，輕輕加入樣品槽模板。約3060 min凝膠完全聚合。加入電極緩沖液，使液面沒過短玻璃板約0.5 cm，輕輕取出樣品槽模板，即可加樣。（4）樣品的處理及加樣。向PCR后得到的樣品中加入5µL 6×loading buffer，混勻后取7µL加入到點樣孔中。另外還要向點樣孔中加入DNA marker，即20bp DNA Ladder。（5）電泳與DNA分離開啟電泳儀電源。選擇合適的電壓（180V）和時間（90min）。

16、將電泳槽電極與電泳儀連接。電泳槽紅色電極為正極，與電泳儀正極相連。電泳槽黑色電極為負(fù)極，與電泳儀負(fù)極相連。啟動電泳，待觀察到負(fù)極有氣泡升起方可離開。電泳結(jié)束，關(guān)閉電源，取出凝膠。EB染色10min。凝膠成像儀成像，觀察電泳結(jié)果，攝片，保存，分析。3結(jié)果（1）此次實驗對人類基因組中3個STR基因座片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增和分離，用到3組相應(yīng)的引物。這3個STR基因座片段的相關(guān)遺傳學(xué)參數(shù)如表四所示。表四 3個STR基因座片段相關(guān)遺傳學(xué)參數(shù)基因座染色體定位核心序列引物名稱PCR產(chǎn)物大?。╞p）等位基因基因型在中國人群中的雜合性（H0）D1S1677chr 1(GGAA)nD1S1677-FD1S1677-

17、R8111771206609D4S2364chr 4(GAAT)n (GGAT)n(GAAT)nD4S2364-FD4S2364-R678351007478D10S1248chr10(GGAA)nD10S1248-FD10S1248-R8312381607652 本次實驗選取這3個STR基因座片段的原因是其在中國人群中的雜合性（H0）較高，即較多人具有這3個STR基因座片段，從而最終得到實驗結(jié)果的可能性較大。 這3個STR基因座片段分別在人類第1對、第4對、第10對染色體上，即均在常染色體上，與性別無關(guān)。這3個STR基因座片段PCR產(chǎn)物大小分別是81117bp、6783bp、83123bp，此

18、次實驗中聚丙烯酰氨凝膠電泳（PAGE）可以分離80110bp的DNA片段，基本與這3個STR基因座片段PCR產(chǎn)物大小接近。（2）這3個STR基因座片段聚丙烯酰氨凝膠電泳實驗結(jié)果如圖一所示。123456圖一STR基因座片段聚丙烯酰氨凝膠電泳實驗結(jié)果 本次實驗使用的DNA marker是20bp DNA Ladder，該制品是由20bp至200bp間隔為20bp的10條片段和300bp、400bp、500bp共13條雙鏈DNA片段組成。其中100 bp、200 bp、500 bp是指示帶，顯示亮帶，其它片段亮度相同。圖一中泳道1、泳道2、泳道6加的樣品是20bp DNA Ladder。泳道1中的2

19、0bp DNA Ladder條帶不明顯，可能原因是加樣量較少或者點樣時間較長導(dǎo)致20bp DNA Ladder彌散。泳道2和泳道6中的20bp DNA Ladder條帶明顯。泳道2和泳道6中可以清楚地看到從上到下3條亮帶，對應(yīng)的DNA片段大小分別是500 bp、200 bp和100 bp。另外其他10條DNA片段也能清楚地看到?？傊?，泳道2和泳道6中的20bp DNA Ladder在此次聚丙烯酰氨凝膠電泳中跑出的條帶很好。泳道3加的是我的STR基因座片段D1S1677，圖一中可以看到1條很明顯的條帶，位于20bp DNA Ladder100 bp條帶附近（圖一中已用“”標(biāo)出），說明該條帶對應(yīng)的

20、DNA片段大小是100 bp左右。從表四可以看出，D1S1677基因座對應(yīng)的STR片段PCR產(chǎn)物大小是81117bp，說明該DNA片段符合理論情況。泳道4加的是我的STR基因座片段D4S2364，圖一中可以看到2條很明顯的條帶。一條條帶位于20bp DNA Ladder 80bp條帶附近（圖一中已用“”標(biāo)出），說明該條帶對應(yīng)的DNA片段大小是80bp左右。從表四可以看出，D1S1677基因座對應(yīng)的STR片段PCR產(chǎn)物大小是6783 bp，說明該DNA片段符合理論情況。不過，另一條條帶位于20bp DNA Ladder 40 bp和60 bp之間并且靠近40 bp（圖一中已用“”標(biāo)出），說明該條

21、帶對應(yīng)的DNA片段大小是40 bp50 bp，沒有在D1S1677基因座對應(yīng)的STR片段理論P(yáng)CR產(chǎn)物大小的范圍內(nèi)，說明該片段有可能是其他DNA片段。泳道5加的是我的STR基因座片段D10S1248，圖一中可以看到從上到下4條較暗的條帶。從上到下第1條條帶位于20bp DNA Ladder140 bp條帶附近（圖一中已用“”標(biāo)出），說明該條帶對應(yīng)的DNA片段大小是140 bp左右。從上到下第2條條帶位于20bp DNA Ladder100 bp條帶稍靠上處（圖一中已用“”標(biāo)出，該方框中有兩條條帶），這說明該條帶對應(yīng)的DNA片段大小比100 bp稍大。從上到下第3條條帶位于20bp DNA La

22、dder100 bp條帶稍靠下處（圖一中已用“”標(biāo)出，該方框中有兩條條帶），這說明該條帶對應(yīng)的DNA片段大小比100 bp稍小。從上到下第4條條帶位于20bp DNA Ladder 40 bp和60 bp中間附近位置處（圖一中已用“”標(biāo)出），這說明該條帶對應(yīng)的DNA片段大小是50 bp左右。從表四可以看出，D10S1248基因座對應(yīng)的STR片段PCR產(chǎn)物大小是83123bp，因此泳道5中從上到下第2條帶和第3條條帶對應(yīng)的DNA片段符合理論情況。泳道5中從上到下第1條帶和第4條條帶有可能是其他DNA片段。在此次實驗中，我分別構(gòu)建了3個PCR反應(yīng)體系，分別對D1S1677、D4S2364和D10S

23、1248這3個STR基因座片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別對應(yīng)泳道3、泳道4和泳道5中的實驗結(jié)果。理論上在每個泳道中會出現(xiàn)12條與理論位置對應(yīng)的條帶，出現(xiàn)1條條帶說明在細(xì)胞染色體中該STR基因座片段有1種，出現(xiàn)2條條帶說明在細(xì)胞染色體中該STR基因座片段有2種。這樣3個泳道共計會出現(xiàn)36條與理論位置對應(yīng)的條帶。但是電泳實驗結(jié)果表明可能存在其他DNA片段的干擾導(dǎo)致出現(xiàn)理論范圍以外的其他條帶。4討論本實驗首先通過磁珠法提取人類基因組DNA，之后對3個STR基因座片段（D1S1677、D4S2364和D10S1248）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后用聚丙烯酰氨凝膠電泳技術(shù)（PAGE）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離，最后PCR產(chǎn)

24、物用EB染色后在紫外燈下觀察實驗結(jié)果并對此進(jìn)行分析。在此次實驗中，我分別構(gòu)建3個PCR反應(yīng)體系，分別對D1S1677、D4S2364和D10S1248這3個STR基因座片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后在3個泳道中分別點樣3種樣品。理論上在每個泳道中會出現(xiàn)12條與理論位置對應(yīng)的條帶。出現(xiàn)1條條帶說明在細(xì)胞染色體中該STR基因座片段有1種，即說明在兩條常染色體中該基因座片段相同，也就是說來自父母親的該基因座片段相同。出現(xiàn)2條條帶說明在細(xì)胞染色體中該STR基因座片段有2種，即說明在兩條常染色體中該基因座片段不同，也就是說來自父母親的該基因座片段不同。這樣3個泳道共計會出現(xiàn)36條與理論位置對應(yīng)的條帶。但是電泳

25、實驗結(jié)果表明可能存在其他DNA片段的干擾導(dǎo)致出現(xiàn)理論范圍以外的其他條帶。本次實驗的關(guān)鍵點是實驗原理要搞清楚，這樣才會做到心中有數(shù)，較好地完成此次實驗。對于此次實驗中其他需要注意的地方如下所示：（1）此次實驗中人類基因組DNA的提取用的是磁珠法。在此方法中，首先裂解液或蛋白酶K可以迅速裂解細(xì)胞并滅活細(xì)胞內(nèi)的核酸酶；其次通過一系列快速的漂洗-分離的步驟，去除細(xì)胞代謝物、蛋白等雜質(zhì)；之后基因組DNA可以選擇性吸附于磁珠；最后用雙蒸水即可將純凈基因組DNA從磁珠上洗脫。整個提取基因組DNA的過程操作簡單，省時省力。（2）在“磁珠法提取人類基因組DNA”中，步驟（2）中加入Buffer MACL、Buf

26、fer MCL和Proteinase K的作用是裂解細(xì)胞。步驟（3）中加入MagicMag Beads之前，要將MagicMag Beads充分顛倒混勻；另外務(wù)必將MagicMag Beads加至液面以下，并盡量將槍頭上殘留的MagicMag Beads吸打干凈。步驟（3）、步驟（5）、步驟（6）中震蕩后如管口沾有少量beads，用微量移液器吸取上清液并將其沖洗至離心管內(nèi)。步驟（3）中加入Buffer MA的作用是協(xié)助磁珠吸附DNA。步驟（4）、步驟（5）、步驟（6）中用微量移液器吸棄上清時盡量吸凈，但要避免吸入Beads。步驟（7）中干燥前應(yīng)盡量吸凈上清，若出現(xiàn)液體掛壁現(xiàn)象，可將離心管短暫離

27、心后，再次將其至于磁力架上1 min；另外室溫開蓋干燥15 min也可以選擇放入37的溫箱，不過放入時間不得超過5min，這一步晾干的目的是使乙醇揮發(fā)，因為殘留的乙醇會對實驗造成影響。步驟（8）中加入TE的作用是溶解DNA。（3）提取出的人類基因組DNA可以在室溫放置24h后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這比立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增的效果好，原因是在室溫放置24h后DNA與水分子充分水合，使DNA結(jié)構(gòu)更好，易于進(jìn)行PCR擴(kuò)增。（4）PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中有ddH2O、反應(yīng)緩沖液、dNTP、引物、耐熱聚合酶和DNA模板。DNA模板對PCR擴(kuò)增的影響有：純度，蛋白質(zhì)、多糖、酚類等雜質(zhì)會抑制PCR反應(yīng)；完整性，DNA模

28、板降解會導(dǎo)致PCR擴(kuò)增無產(chǎn)物； 濃度，DNA模板加量過多導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加。引物對PCR擴(kuò)增的影響有：特異性，引物的長度要適當(dāng)，避免二級結(jié)構(gòu)和二聚體的出現(xiàn)；完整性，引物要避免反復(fù)凍融； 濃度，引物的濃度應(yīng)適當(dāng)，濃度過高導(dǎo)致非特異性增加，濃度過低則導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物太少。反應(yīng)緩沖液在PCR反應(yīng)過程中起到穩(wěn)定劑和增強(qiáng)劑的作用，其對PCR擴(kuò)增的影響有：pH值，鹽離子濃度。在反應(yīng)緩沖液中，Mg2+濃度過高會導(dǎo)致PCR非特異性嚴(yán)重，過低會導(dǎo)致無擴(kuò)增產(chǎn)物。dNTP Mixture要注意濃度適當(dāng)和避免反復(fù)凍融，ddH2O要注意pH值適當(dāng)和避免污染。選擇最合適的DNA聚合酶要看其特性，包括純度、穩(wěn)定性和酶活性。（5）此次實驗中建議分別構(gòu)建3個PCR反應(yīng)體系，分別對D1S1677、D4S2364和D10S1248這3個STR基因座片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這樣更容易得到實驗結(jié)果。在此次實驗的PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建中，緩沖液要含有Mg2+。PCR反應(yīng)條件的設(shè)定中預(yù)變性的條件是94 10min，這是因為人類的基因組較大，需要的變性時間長。如果PCR反應(yīng)沒有擴(kuò)增出目的DNA片段，首