IHC的四種基本類型

1、IHC , 是免疫組織化學(xué)Immunohistochemistry的簡稱,是以免疫學(xué)的抗原 -抗體反響為理論根底,用標(biāo)記的特異性抗體抗原,對組織的相應(yīng)抗原抗體進(jìn)展定位、定性 和半定量檢測,經(jīng)組織化學(xué)顯色反響, 利用光鏡、熒光顯微鏡或電子顯微鏡進(jìn)展實驗結(jié)果觀察的一項技術(shù).假設(shè)該技術(shù)主要用于研究和觀察細(xì)胞的某些成分,又可稱為ICC,即免疫細(xì)胞化學(xué)Immunocytochemistry .研究對象,所有能作為抗原或者半抗原的物質(zhì),如蛋白質(zhì)、多肽、核酸、酶、激素、磷 脂、多糖以及病原體等,都可以成為它的研究對象.其優(yōu)勢在于特異性高, 敏感性高,方法步驟統(tǒng)一,形態(tài)、功能和代謝密切結(jié)合等方面.因此,IHC

2、/ICC 已成為臨床病理不可或缺的輔助手段,尤其是根據(jù)該技術(shù)檢測結(jié)果的表達(dá)水平所開展起來的相關(guān)“個體化治療方案,使免疫組化的質(zhì)量及質(zhì)控治理愈來愈受到高度重視.IHC/ICC主要有四種根本類型1傳統(tǒng)直接法新型直接法原理傳統(tǒng)直接法,將的特異性抗體與標(biāo)記物結(jié)合,制備成標(biāo)記抗體,再用標(biāo)記抗體直接與標(biāo)本的相應(yīng)抗原結(jié)合,光鏡下觀察抗原存在部位呈現(xiàn)特異性標(biāo)記.新型直接法,采用一種具有惰性的多聚化合物葡聚糖為骨架,將特異性抗體和HRP結(jié)合在骨架上,形成HRP-葡聚糖-特異性抗體的巨大復(fù)合物,其的特異性抗體直接與標(biāo)本的相 應(yīng)抗原結(jié)合,經(jīng)酶促反響,即可在光鏡下觀察特異性陽性結(jié)果,也叫多聚螯合物酶法EPOS 法En

3、hanced Polymer One-step Stainning.優(yōu)點傳統(tǒng)直接法,特異性強(qiáng),非特異性反響較少,技術(shù)操作簡便.新型直接法,敏感性極強(qiáng),背景無染色,大大縮短了試驗時間,是目前最簡便的免疫組織化學(xué)方法,用于冰凍切片作用尤為突出.缺點傳統(tǒng)直接法必須標(biāo)記每一種特異性抗體,且只能檢測一種抗原, 敏感性較差,同時反響的信號也較小,特別是對于組織或細(xì)胞微量的抗原檢測.新型直接法商品化的 EPOS品種不多,試劑價格較昂貴.2.word.zl-傳統(tǒng)直接法新型直接法原理傳統(tǒng)間接法是用未標(biāo)記的一抗與標(biāo)本的相應(yīng)的抗原物質(zhì)結(jié)合,用標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合,通過熒光顯微鏡觀察,或經(jīng)過酶促反響后利用光鏡觀察有色

4、的陽性反響產(chǎn)物.新型間接法是將標(biāo)本的抗原與一抗結(jié)合后,標(biāo)記有多聚化合物酶復(fù)合物的二抗與一抗結(jié)合,經(jīng)酶促反響進(jìn)展顯色定位,也叫 EnVision法.注：EnVision復(fù)合物是由二抗分子的一個 Fab段與HRP/ALP通過聚合技術(shù)結(jié)合在線狀的葡聚糖上而 形成.優(yōu)點傳統(tǒng)間接法一個一抗可以結(jié)合多個二抗抗體分子,增強(qiáng)了免疫反響信號,敏感性比直接法增大3-4倍；一抗使用濃度較直接法低；不用直接標(biāo)記一抗,標(biāo)記的二抗可以用于多種一抗.新型間接法每一分子的 EnVision復(fù)合物中約含有 70個酶分子和10個二抗分子,具有 高度的方法作用,也增加了與一抗分子的結(jié)合時機(jī)；機(jī)體不存在這種葡聚物,背景非常干凈； 染

5、色步驟分為兩步,操作簡便省時.缺點傳統(tǒng)間接法特異性低于直接法,容易出現(xiàn)非特異性染色； 染色步驟較多,染色所需時間延長.新型間接法是目前最優(yōu)化的方法.酶橋法3PAP法原理酶橋法是制備同種屬的特異性一抗和抗酶抗體三抗,利用二抗作為橋梁將三抗與一抗連接起來,三抗的標(biāo)記酶經(jīng)酶促反響,即可在抗原位置上呈現(xiàn)有色陽性反響產(chǎn)物.PAP法那么是借助二抗的橋梁作用,將PAP/ALP復(fù)合物連接在與組織抗原結(jié)合的一抗上.PAP復(fù)合物由3分子酶和2分子的抗酶抗體構(gòu)成, 抗酶抗體和一抗為同種屬動物的IgG,經(jīng)相應(yīng)的酶促反響,可通過顯微鏡觀察到陽性結(jié)果.word.zl-優(yōu)點酶橋法3種抗體均被酶標(biāo)記, 酶是通過免疫學(xué)原理被標(biāo)

6、記在三抗上,預(yù)防了因化學(xué)方式結(jié)合對抗體和酶活性的損害,提升了方法的敏感性,節(jié)省了一抗的用量.PAP法抗體活性高,靈敏度高,背景染色低.缺點酶橋法標(biāo)記的酶類很難被準(zhǔn)確的稀釋到恰當(dāng)?shù)臐舛?以到達(dá)和三抗的抗酶部位全部結(jié)合,同時也難以徹底洗脫掉與標(biāo)本中其他成分非特異性結(jié)合的酶,造成較高的非特異性染色.PAP法染色步驟較多,需要的染色時間長.4ABC法SP法原理ABC法即抗生物素-生物素-過氧化物酶法,它的關(guān)鍵是 ABC復(fù)合物,由一個卵白素分子結(jié)合3個生物素化的過氧化物酶分子構(gòu)成.卵白素作為“橋連接在生物素標(biāo)記的過氧化物酶與生物素標(biāo)記的抗體之間, 于是形成一個含有 3個以上過氧化物酶分子的網(wǎng)格狀復(fù)合物,

7、通過ABC復(fù)合物中卵白素與生物素化抗體結(jié)合,經(jīng)過組織化學(xué)的酶顯色反響,到達(dá)檢測組織 或細(xì)胞原位抗原的目的.SP法即鏈霉抗生物素-生物素法,與ABC法相似,不同的是鏈霉抗生物素蛋白與生物素 化酶HRP結(jié)合,形成鏈霉抗生物素 -生物素化酶復(fù)合物,這種復(fù)合物再與生物素標(biāo)記的 二抗結(jié)合,通過酶的顯色反響檢測抗原存在的部位.優(yōu)點ABC法敏感性高相對于 PAP法,特異性強(qiáng),尤其適用于單克隆抗體,組織背景染色淺, 操作方法簡便,節(jié)省染色時間.SP法相比ABC法,有效地降低了源性生物素帶來的非特異性反響的程度,敏感性增加 了 4-8 倍.缺點.word.zl-ABC法使用時某些器官或者組織的源性生物素與卵白素

8、特異性結(jié)合,引起非特異性反 響增強(qiáng).隨著免疫組織化學(xué)各項技術(shù)的開展應(yīng)用,相繼建立了多種不同的標(biāo)記抗體的方法,因而也就產(chǎn)生了與其相應(yīng)的各種免疫組織細(xì)胞化學(xué)技術(shù).根據(jù)標(biāo)記物的不同,可以分為：免 疫熒光組織細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、免疫酶組織細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、免疫鐵蛋白標(biāo)記技術(shù)、免疫 金銀標(biāo)記技術(shù)、親和免疫組織化學(xué)技術(shù)、免疫電子顯微鏡技術(shù)、雜交免疫組織細(xì)胞化學(xué) 技術(shù)、免疫雙重和多重組織細(xì)胞化學(xué)技術(shù).以上都是理論,來看一點實際的.操作流程現(xiàn)從取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色和封固這9個過程詳盡的介紹最常用的石蠟切片免疫組織化學(xué)技術(shù).一、標(biāo)本取材,取材是標(biāo)本制備過程的第一步,取材是否科學(xué),是否符合實驗要求

9、,將 直接影響光鏡下組織或細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察.不管取材的標(biāo)本來自何種途徑,首先應(yīng)盡量保證所取材標(biāo)本的形態(tài)完整性和材料新鮮性.由于死亡兩小時以上的標(biāo)本,其組織或細(xì)胞將呈現(xiàn)出不同程度的自溶,有些抗原可能會出現(xiàn)變形、彌散和消失的現(xiàn)象.這些都不利于抗原抗體 的結(jié)合,從而直接地影響免疫組織化學(xué)反響,導(dǎo)致實驗結(jié)果的偏差.因此,取材要求準(zhǔn)確、 迅速和完整,以免因操作不當(dāng)造成抗原破壞或喪失,影響實驗結(jié)果的正確性.舉三個例子活檢標(biāo)本/病理標(biāo)本,對于病變部位大的標(biāo)本,取材要具有代表性,在保證組織構(gòu)造完整的情況下,可適當(dāng)分割成為較薄的標(biāo)本塊,其中應(yīng)包括：主要病灶、病灶與正常組織交界處、病灶周圍的正常組織.實驗動物標(biāo)本

10、,根據(jù)實驗?zāi)康暮鸵筮x擇正確的動物麻醉方法或者處死方法進(jìn)展取材.細(xì)胞標(biāo)本,不管是獲取的新鮮細(xì)胞液,還是經(jīng)過酶消化作用而制備成的細(xì)胞懸浮, 都可以通 過離心沉淀的方法使細(xì)胞濃縮成細(xì)胞團(tuán), 吸出上清液.注意緩慢參加固定劑,不要將細(xì)胞團(tuán) 沖散.固定時間一般為 1-6小時.二、標(biāo)本固定,用于標(biāo)本固定的固定劑種類很多,不同的固定劑固定的標(biāo)本適用于不同的實驗?zāi)康?應(yīng)根據(jù)檢測物質(zhì)的抗原性質(zhì)、所使用的抗體特征以及固定劑的性質(zhì)選擇適宜的固定劑.目前用于免疫組化實驗的常用固定劑有以下幾種：10%福爾馬林緩沖液pH 7.4配制方法：10%甲醛溶液參加 0.01 mol/L pH 7.4 PBS緩沖液90 mL,混合

11、均勻,即為 10%福 爾馬林緩沖液.word.zl-適用圍：該固定液廣泛適用于標(biāo)本的固定,既能有效的保護(hù)標(biāo)本的組織或細(xì)胞形態(tài)構(gòu)造,又能保持標(biāo)本的抗原活性,只是甲醛的交聯(lián)作用會對某些抗原外表的抗原決定簇有一定的封閉 作用,因此要在染色前對封閉的抗原決定簇進(jìn)展暴漏,即抗原修復(fù).常規(guī)大小的標(biāo)本塊,固定時間為12-24小時.4%多聚甲醛緩沖液pH 7.4配制方法：多聚甲醛 40 g溶于0.01 mol/L pH 7.4 PBS緩沖液500 mL,攪拌加熱至60C,滴 加1 mol/L氫氧化鈉至溶液清澈,冷卻至室溫,最后補(bǔ)加PBS達(dá)總體積為1000 mL,過濾,即為4%多聚甲醛緩沖液,4c冰箱保存.適用

12、圍：它對標(biāo)本的滲透性較強(qiáng)且產(chǎn)生的收縮小,由于其 pH近中性,可以最大限度的 保存抗原的活性,由于該固定劑性質(zhì)較為溫和,于4c保存較長時間的標(biāo)本,仍可獲得滿意的實驗結(jié)果.同時也適用于標(biāo)本灌注固定,灌注后的標(biāo)本再在此固定劑中浸泡固定6-12小時即可.Bouin固定劑配制方法：在75 mL的飽和的苦味酸溶液中參加 25 mL 10%甲醛溶液,再參加 5 mL冰 醋酸,混合后即為 Bouin液.適用圍：它也是形態(tài)學(xué)常用的固定劑, 對于某些抗原的保存較 10%福爾馬林緩沖液更適合免 疫細(xì)胞化學(xué)的研究.對標(biāo)本的滲透性強(qiáng),產(chǎn)生的收縮少,但其pH為3-3.5,對標(biāo)本的抗原可能有一定的損壞,因此標(biāo)本不適合在固定

13、劑中長期停留.三、標(biāo)本處理脫水-透明-浸蠟-包理-切片-染色-固封常用染色方法步驟 脫蠟：二甲苯,室溫,兩次,每次 20分鐘.水合：100% 100% 95% 90% 80% 70%乙醇一蒸儲水,每級 5分鐘.3%過氧化氫,室溫孵育 10分鐘.蒸儲水沖洗. PBS浸洗5分鐘.抗原修復(fù).PBS洗滌3分鐘,3次.word.zl-封閉用血清,室溫孵育 10-30分鐘,傾去血清,勿洗.滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗,37c孵育60-90分鐘,或者4c過夜.PBS洗滌3分鐘,3次.生物素標(biāo)記的二抗,室溫 30分鐘.PBS洗滌3分鐘,3次.ABC復(fù)合物,室溫孵育 30-60分鐘.ABC法or辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉抗生物