多糖生物膜在骨組織工程中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究(一)

1、多糖生物膜在骨組織工程中應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)研究一 倪建光,劉丹平,韓寶芹【摘要】目的在骨組織工程的載體外包裹多糖生物膜PSBM減少種子細(xì)胞在復(fù)合載體時(shí)的外溢逃出,驗(yàn)證其在組織工程中應(yīng)用的可行性.方法用全骨髓法獲得骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,體外擴(kuò)增后,取第三代細(xì)胞種 植于支架材料載體多孔納米磷灰石-硅灰石生物活性玻璃陶瓷/殼聚糖復(fù)合支架材料A-W-MGC/CS上,分2組,實(shí)驗(yàn)組載體外用多糖生 物膜物理包裹,對(duì)照組不包裹多糖生物膜,觀察載體外培養(yǎng)皿上的細(xì) 胞生長(zhǎng)數(shù)量；MTT檢測(cè)細(xì)胞活力；電鏡觀察載體上細(xì)胞粘附生長(zhǎng)情況. 結(jié)果實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)板上載體外漏細(xì)胞較少,對(duì)照外漏細(xì)胞較多：MTT檢測(cè)兩組細(xì)胞活力差異無顯著性P>

2、; 0.05;電鏡觀察實(shí)驗(yàn)組載體上細(xì)胞 粘附生長(zhǎng)較對(duì)照組稍優(yōu).結(jié)論多糖生物膜在骨組織工程中具有應(yīng)用前 景.【關(guān)鍵詞】多糖生物膜骨髓基質(zhì)干細(xì)胞BMSCS支架材料組織工程 Abstract:ObjectiveTopackbonetissueengineeringcarrierwithpolysaccharide biomembranetodecreaseseed-cells leaking.andtoauthenticatethefeasibili tyofapplyingpolysaccharidebiomembraneinbonetissueengineering.Method sBonema

3、rrowstromalcellswerederivedthroughwhole-bone-marrowmetho d,and,afteramplificationinvitro,thecellsofthethirdgenerationwereimplante dinA-W-MGC/CS.Thenthecellsweredividedintotwogroups-anexperimentalg roupwithcarrierpackedwithPSBMandacontrolgroupwithcarrierun-packed.T henumberofcellgrowinginculturedisho

4、utofthecarrierwasobserved , thestateofcellvigorwasdetectedwithMTT,andthestateofcelladhesionwasobs ervedwithelectronmicroscope.ResultsThenumberofleakingcellintheexperi mentalgroupwaslessthanthatinthecontrolgroup.TheresultofMTTdetections howedthatdifferenceofcellvigorbetweentwogroupswasun-significant(

5、P < 0.05).Thegrowingstateofcellintheexperimentalgroupwasbetterthanthatinth econtrolgroupunderelectronmicroscope.ConclusionsPolysaccharidebiome mbranehasanappliedprospectinBonetissueengineering. Keywords polysaccharidebiomembrane;bonemarrowstromalstemcell;bracketmateria l;tissueengineering 骨組織工程的核

6、心是在體外培養(yǎng)細(xì)胞,然后將細(xì)胞種植到具有一定結(jié) 構(gòu)的三維支架上,再將這種細(xì)胞生物材料復(fù)合體植入骨缺損部位,通 過生物過程使細(xì)胞長(zhǎng)入多孔支架中,即經(jīng)過細(xì)胞間相互粘附、增殖、 分化,分泌細(xì)胞外基質(zhì)最終形成具有一定結(jié)構(gòu)和功能的組織或器官, 從而到達(dá)骨修復(fù)的目的.細(xì)胞和支架材料的相互作用又起到關(guān)鍵的作 用,減少細(xì)胞復(fù)合材料又未貼附在支架材料這段時(shí)間的外漏,可以有 效的減少種子細(xì)胞的損失,增加細(xì)胞與支架材料之間的作用時(shí)間,更 利于細(xì)胞粘附.由中國(guó)海洋大學(xué)生命學(xué)院研制的多糖生物膜 (polysaccharidebiomembrane,PSBM 是一種平安無毒,具有很好生物 相容性的細(xì)胞培養(yǎng)移植載體.多糖生

7、物膜是由殼聚糖衍生物(竣甲基 殼聚糖、透明質(zhì)酸及明膠按特定比例混合制成的膜型制劑.具分子量 約為2000Da,透水率為10區(qū)L/mincm2.為了提升載體內(nèi)外液體中 大分子物質(zhì)的流通,我們用顯微穿刺的方法在多糖生物膜上增加孔隙直徑約為20、孔間距為100150 wm.耿燕、王曉莉1, 2等 將其應(yīng)用于眼科的研究.本實(shí)驗(yàn)研究將多糖生物膜應(yīng)用于骨組織工程 的可行性.1材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物23月齡清潔級(jí)日本大耳白兔1只,體重1.5kg,由遼寧醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物中央提供.1.2 實(shí)驗(yàn)材料多孔納米磷灰石-硅灰石生物活性璃玻陶瓷/殼聚糖復(fù)合支架材料A-W-MGC/CS 由四川大學(xué)無機(jī)非金屬材料系周大利

8、教授課題組提 供,多糖生物膜中國(guó)海洋大學(xué)生命學(xué)院提供,高糖DMEM Gibco, 胎牛血清北京華美,Hepes 北京華美,0.25%胰酶,MTT,二甲基 亞碉,96孔一次性培養(yǎng)板,CO2培養(yǎng)箱,倒置相差顯微鏡,JSM-5900LV 掃描電鏡.1.3 實(shí)驗(yàn)方法1.3.1BMSCs的別離培養(yǎng)取1.52月齡的日本大耳白兔,雌雄不限,速眠新 II0.2mL/kg肌注麻 醉,無菌條件下于脛骨上端抽取約 4mL骨髓,在超凈工作臺(tái)上將骨髓參加無菌培養(yǎng)瓶中,再參加4mL含10%!臺(tái)牛血清的DMEM培養(yǎng)液以下稱生長(zhǎng)培養(yǎng)基充分吹打,按每瓶2mL參加到30cm2的培養(yǎng)瓶中,補(bǔ)充2mL的生長(zhǎng)培養(yǎng)液,放入37C、5%C

9、O2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).5天 后首次換液,以后每3天換液1次,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情 況.待貼壁細(xì)胞接近 80%融合后,結(jié)束原代培養(yǎng).吸去生長(zhǎng)培養(yǎng)基, 用無血清DMEM洗1次,參加0.25%夷蛋白酶1.5mL/瓶消化35分鐘, 并在倒置顯微鏡下觀察消化效果.當(dāng)有局部細(xì)胞脫壁、大局部細(xì)胞間 隙變大時(shí)參加生長(zhǎng)培養(yǎng)基 3.0mL/瓶終止消化.細(xì)胞沉淀用生長(zhǎng)培養(yǎng)基 吹打成單細(xì)胞懸液并按1 : 3比例分裝傳代,以后每3d換液1次.1.3.2BMSC離合A-W-MGC/CS及包裹多糖生物膜將制作好的 A-W-MGC/CS12mmc5mme5mm,孔徑在 100500m, 孔隙率為80%90%,經(jīng)環(huán)

10、氧乙烷消毒后放置1個(gè)月,用前PBS沖洗3 遍,用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液浸泡置于37 C、5%CO2恒溫細(xì)胞 培養(yǎng)箱中7天,去掉培養(yǎng)液,在培養(yǎng)箱中自然晾干待用.將多糖生物 膜修剪成5cmx3cm大小見圖1,浸泡于0.05M的磷酸鹽緩沖液24 小時(shí)中間換液1次,121 C高壓濕熱滅菌.手工將多糖生物膜從底 面及側(cè)壁包裹晾干的A-W-MGC/CSM合支架材料可吸收線系好備用見 圖2.取第三代BMSCs?肖化離心制成1X106勺細(xì)胞懸液種植于實(shí)驗(yàn)組 包裹有經(jīng)穿刺過的多糖生物膜的 A-W-MGC/CS上,另一組細(xì)胞直接種 植A-W-MGC/CS上,每組6塊,放入24孔培養(yǎng)板上,在37c , 5%C

11、O2 飽和濕度的孵箱中孵育.2h后翻面,4h后參加20% FBS勺根底培養(yǎng)液, 每孔1.5mL,培養(yǎng)7d,隔天更換培養(yǎng)液.1.4檢測(cè)工程1.4.1 MTT值測(cè)定增值曲線的繪制取第三代生長(zhǎng)細(xì)胞種植于96孔培養(yǎng)板上,分2組,實(shí)驗(yàn)組為浸泡有多 糖生物膜的生長(zhǎng)培養(yǎng)液,對(duì)照組為正常生長(zhǎng)培養(yǎng)液.每板種植21個(gè)孔, 每孔接種2X10訃細(xì)胞,200區(qū)綜養(yǎng)液,每48小時(shí)換液.每日取3孔 細(xì)胞,觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,參加20LMTT4h后盡量吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液, 參加150M二甲基亞碉,振蕩10min,以490nm為測(cè)量波長(zhǎng),以空白 孔為對(duì)照,用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)各孔吸光度值 【D (490)】,根據(jù)MTT 值繪制細(xì)胞增殖曲線.1.4.2 倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)板上細(xì)胞外漏情況24小時(shí)后取24孔培養(yǎng)板,在倒置顯微鏡下觀察支架材料外,培養(yǎng)板底 外漏的細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)情況并細(xì)胞計(jì)數(shù),細(xì)胞實(shí)際種植數(shù)=細(xì)胞種植總數(shù) -培養(yǎng)板底部外漏細(xì)胞數(shù).種植率=細(xì)胞實(shí)際種植數(shù)/細(xì)胞種植總數(shù) x 100%1.4.3 電鏡觀察支架材