燈盞細(xì)辛對神經(jīng)細(xì)胞尼古丁受體表達(dá)的影響及其神經(jīng)保護(hù)作用研究

1、燈盞細(xì)辛對神經(jīng)細(xì)胞尼古丁受體表達(dá)的影響及其神經(jīng)保護(hù)作用研究                       作者：齊曉嵐，黃勇，王永林，王愛民，官志忠【摘要】  目的研究中藥燈盞細(xì)辛對神經(jīng)母細(xì)胞瘤 （SH-SY5Y） 細(xì)胞神經(jīng)型尼古丁受體表達(dá)的影響及其對抗淀粉樣蛋白 （A）神經(jīng)毒性作用機制。方法采用比色法測定細(xì)胞 MTT 還原率篩選藥物濃度安全范圍，選取一定濃度的燈盞細(xì)辛

2、乙醇提取物醋酸乙酯部位處理 SH-SY5Y 細(xì)胞后，再加入 A1-42 處理，測定 MTT 還原率，蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting ）方法測定神經(jīng)型尼古丁受體 3、7 蛋白表達(dá)的變化；采用改進(jìn)的Ellman比色法測定細(xì)胞培養(yǎng)基中乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）及丁酰膽堿酯酶（Butyrylcholinesterase，BuChE）活性。結(jié)果燈盞細(xì)辛乙醇提取物醋酸乙酯部位能提高細(xì)胞 3 及 7 尼古丁受體亞單位蛋白質(zhì)表達(dá)水平；降低細(xì)胞乙酰膽堿酯酶活性；并能對抗 A 引起的MTT還原率降低。結(jié)論燈盞細(xì)辛乙醇提取物醋酸乙酯部位能上調(diào)尼古丁受體亞單位蛋

3、白表達(dá)水平，降低細(xì)胞乙酰膽堿酯酶活性，且能對抗 A 的神經(jīng)毒性作用，在阿爾茨海默氏病的治療中可能起到一定作用。 【關(guān)鍵詞】  燈盞細(xì)辛； SH-SY5Y細(xì)胞； 尼古丁受體； -淀粉樣蛋白； 膽堿酯酶； 阿爾茨海默氏病Abstract：ObjectiveTo investigate the effects of Herba Erigeromtis on the expression of nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) and the anti-neurotoxicity mechanism of the drug by using n

4、euroblastoma SH-SY5Y cells treated with beta-amyloid peptide.MethodsThe SH-SY5Y cells were treated by Herba Erigeromitis, and then exposed to A1-42. MTT reduction assay was used to choos a safe-dose concentration of Herba Erigeromitis and to understand the influences of the drugs on cellular viabili

5、ty resulted from the treatment of A; expressions of 3 and 7 nAChR subunits at protein level were detected by Western-blotting. The levels of acetylcholinesterase (AChE) and butyrylcholinesterase (BuChE) activities in cell culture mediums were meatured by an improved Ellmans colorimetric method. Resu

6、ltsHerba Erigeromtis stimulated increases of 7 and 3 nAChR proteins in the cultured cells; decreased the activity of AChE and inhibited the decreased MTT reduction resulted from A. ConclusionHerba Erigeromtis can upregulate the expression of nAChR subunits at protein level, decrease the activity of

7、AChE and prevent the decreased MTT reduction induced by A. The drugs might play an important role in therapeutic strategy of AD.Key words： SH-SY5Y cells;   nAChR;   -amyloid pepitide;   Alzheimer disease;   cholinesterase;   Herba Erigeromtis &#

8、160;  阿爾茨海默氏病（Alzheimer's disease， 簡稱AD）是一種主要在老年期發(fā)生的以進(jìn)行性癡呆為主要特征的神經(jīng)元退行性變疾病，其主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、記憶力衰退、性格和行為改變等13。近一個世紀(jì)以來，眾多的科學(xué)家就AD的病因及發(fā)病機制進(jìn)行了大量的研究，但其發(fā)病機制至今尚不十分清楚。目前認(rèn)為AD是由遺傳學(xué)因素、環(huán)境因素和代謝因素等多種因素共同作用所引起的一種疾病，病理學(xué)上以腦細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)及細(xì)胞外老年斑形成為主要特征1。老年斑的主要成分為淀粉樣蛋白，是一種神經(jīng)毒性物質(zhì)，可以引起神經(jīng)元的損傷和死亡，是AD發(fā)病過程中的一個重要因素，能促進(jìn)AD

9、的發(fā)生和發(fā)展。    神經(jīng)型尼古丁乙酰膽堿受體(Nicotinic acetylcholine receptor, nAChR )（或稱尼古丁受體）與學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知功能密切相關(guān)，并具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用4。在較早的一些研究中就發(fā)現(xiàn)，AD患者大腦皮層nAChR出現(xiàn)持續(xù)和嚴(yán)重的丟失，大腦皮層nAChR缺失與AD患者認(rèn)知障礙有顯著的相關(guān)性。膽堿酯酶（Cholinestease，ChE）是一類絲氨酸水解酶，其功能主要為水解興奮性神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿?？煞譃閮深?，乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase, AChE）與丁酰膽堿酯酶（Butyrylcholines

10、terase，BuChE）。近幾年的研究表明，AChE和BuChE在AD的發(fā)病過程中起著重要的作用，且它們的水解底物ACh缺失的嚴(yán)重程度與癡呆密切相關(guān)5。在AD 病人腦中，總AChE 的酶活性是下降的，然而在老年斑中以及其周圍AChE活性卻是升高的，其能促進(jìn)A的聚集，并加速其沉淀，形成不可溶的淀粉樣斑塊 6。    由于AD的發(fā)病機制復(fù)雜，盡管世界各國在尋找有效治療藥物的研究中投入了大量人力和物力，但成果卻十分有限，目前世界上最為成熟和成功的方法是采用膽堿酯酶抑制劑（Cholinestease inhibitor，ChEI），以提高患者腦內(nèi)ACh的水平、補償膽堿能

11、功能的缺失，也是唯一一種通過美國FDA批準(zhǔn)用于治療AD的藥物7。但是，膽堿酯酶抑制劑只能緩解AD的臨床癥狀，而無法達(dá)到根治的作用。中藥是我國獨特的資源，在治療上具有多途徑、多靶點、毒副作用較小等特點，中醫(yī)藥學(xué)從整體觀念出發(fā)，辨證論治，并積累了豐富的經(jīng)驗。燈盞細(xì)辛具有抗血栓,抗缺血,腦缺血再灌注神經(jīng)損傷保護(hù)作用，且燈盞細(xì)辛乙醇提取物顯示-淀粉樣肽聚集抑制活性8。本研究用A1-42處理來源于人腦的神經(jīng)母細(xì)胞瘤（SH-SY5Y）細(xì)胞作為研究對象，以研究燈盞細(xì)辛神經(jīng)保護(hù)作用機制。1  試劑及樣品      燈盞細(xì)辛由貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院制備、提供

12、，燈盞藥材以95乙醇提取2次，回收乙醇后，以水混懸，取樣?；鞈宜芤捍姿嵋阴ポ腿?shù)次，醋酸乙酯層合并回收溶劑得燈盞細(xì)辛乙醇提取物醋酸乙酯部位。    D-MEM培養(yǎng)液購自Gibco Invitrogen公司（英國）；源于人腦的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株（SH-SY5Y細(xì)胞）購于German Collection of Microorganisms and Cell Cultures公司（德國）；羊抗 3、7 及鼠抗 -肌動蛋白（-actin ）多克隆抗體及HRP標(biāo)記的抗羊及抗鼠二抗購自Santa Cruz Biotechnology Inc (美國)。聚乙烯二氟（PVDF

13、）膜、ECL-Plus發(fā)光試劑、高效顯影膠片購自Amersham公司；膽堿酯酶測定試劑及其它化學(xué)試劑均購自Sigma公司。2  方法2.1  細(xì)胞培養(yǎng)，-淀粉樣肽及燈盞細(xì)辛的處理先用含15胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng) SH-SY5Y 細(xì)胞，待細(xì)胞生長穩(wěn)定后，改用不含血清的 DMEM 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱中含5% CO2，溫度為37 。在 SH-SY5Y 細(xì)胞中加入1mol/L的A1-42，培養(yǎng)48 h。為觀察燈盞細(xì)辛對A毒性作用的影響，先加入3mg/mL燈盞細(xì)辛乙醇提取物醋酸乙酯部位培養(yǎng)24 h后，再加入 1mol/LA 1-42培養(yǎng)48 h。2.2  3-

14、4,5-二甲基噻唑-2,5-二酚四唑溴化物3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT 測定MTT是一種四甲基偶氮唑鹽，經(jīng)活細(xì)胞線粒體琥珀酸脫氫酶催化可生成藍(lán)紫色的還原型MTT，該產(chǎn)物在490 nm波長處有極大的吸收峰。比色法測定MTT水平9，常用來表示細(xì)胞的損傷程度和功能狀況。    為篩選燈盞細(xì)辛的安全濃度，選擇0.0510 mg/ml 濃度處理 SH-SY5Y 細(xì)胞后24 h后測定MTT還原率，以檢測其對細(xì)胞是否具有毒性作用及其安全濃度范圍。2.3  尼古丁受體亞

15、單位蛋白表達(dá)測定參照 Guan 等10的方法進(jìn)行提取細(xì)胞膜蛋白及用西印跡（Western blotting）方法檢測 3，7 nAChR亞單位蛋白水平。以Labworks軟件分析結(jié)果時以-Actin蛋白條帶作為內(nèi)參照，計算3、7 nAChR蛋白條帶與-Actin蛋白條帶像素灰度的百分比值作為3、7 nAChR蛋白質(zhì)表達(dá)的相對水平比。2.4  體外培養(yǎng)的細(xì)胞膽堿酯酶活性測定收集細(xì)胞培養(yǎng)基，加入的培養(yǎng)基量按照蛋白定量的結(jié)果使其含有相同的蛋白質(zhì)克數(shù)。96孔酶標(biāo)板每孔總體系為200 l，每孔加培養(yǎng)基10 l，按表1加樣。表1  細(xì)胞膽堿酯酶活性測定（略）于室溫避光處準(zhǔn)確反應(yīng)15 m

16、in后，在酶標(biāo)儀412 nm波長下比色。    計算公式為：AChE或BuChE活性單位=2.941×OD（測定值-對照值）2.5  統(tǒng)計學(xué)分析每組所得結(jié)果用±s表示，結(jié)果用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析。*P<0.05或*P<0.01表示差異有顯著性或高度顯著性意義。3  結(jié)果3.1  中藥安全濃度篩查燈盞細(xì)辛乙醇提取物醋酸乙酯部位在所選濃度范圍內(nèi)對 SH-SY5Y 神經(jīng)細(xì)胞 MTT 還原率無明顯影響，表明其對細(xì)胞毒性作用較小。因此選擇 3 mg/ml 作為本次研究燈盞細(xì)辛的選用濃度（圖1

17、）。圖1  經(jīng)不同濃度燈盞細(xì)辛乙醇提取物乙酸乙酯部位處理的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞MTT還原率 （略）3.2  藥物處理后 MTT 還原率測定藥物處理后 MTT 還原率測定發(fā)現(xiàn)，1 mmol/L A1-42處理細(xì)胞后引起MTT 還原率明顯降低；3 mg/ml 燈盞細(xì)辛乙醇提取物醋酸乙酯部位處理細(xì)胞不影響細(xì)胞功能；而用燈盞細(xì)辛預(yù)處理細(xì)胞后可明顯減弱 A 對細(xì)胞的毒性作用，A 組與燈盞細(xì)辛+A組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。3.3  尼古丁受體亞單位蛋白表達(dá)水平3 及 7 nAChR亞單位蛋白質(zhì)表達(dá)水平結(jié)果表明，燈盞細(xì)辛處理細(xì)胞可上調(diào)細(xì)胞 3 及

18、7 nAChR亞單位蛋白質(zhì)表達(dá)水平（P<0.01）。見圖3。3.4  細(xì)胞膽堿酯酶測定結(jié)果細(xì)胞經(jīng)3 mg/ml燈盞細(xì)辛乙醇提取物醋酸乙酯部位處理組AChE活性值為（11.69±1.21） nmol?min-1?ml-1，較空白對照組的（15.86±0.47）nmol?min-1?ml-1降低26.29，差別存在統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。百事通    各處理組BuChE活性值分別為：空白對照組（10.88±0.33） nmol?min-1?ml-1，燈盞細(xì)辛乙醇提取物處理組1（1.16±1.23） nm

19、ol?min-1?ml-1。兩組間BuChE活性值差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)燈盞細(xì)辛及A處理后MTT還原率測定，結(jié)果用單因素方差分析法統(tǒng)計分析 (n=6)， *表示與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；表示與A處理組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Con：對照組；A：A處理組，DZXX：單純燈盞細(xì)辛處理組，DZXX+A：燈盞細(xì)辛和A處理組圖2  SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞藥物處理后MTT還原率（略）SHSY5Y細(xì)胞經(jīng)燈盞細(xì)辛處理后，用Western blotting法測定SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞3及a7尼古丁受體亞單位蛋白質(zhì)

20、表達(dá)水平，結(jié)果用單因素方差分析法統(tǒng)計分析 (n=6)， *表示與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。Con：對照組，DZXX：燈盞細(xì)辛處理組圖3  SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞藥物處理后3及7尼古丁受體亞單位蛋白質(zhì)表達(dá)水平（略）4  討論    大量研究已經(jīng)證明在 AD 腦組織中老年斑的主要成分A是由其前體蛋白（-Amyloid precursor peptide, APP）經(jīng)分泌酶 - 和 - 水解后形成的，具有一定的神經(jīng)毒性作用。近來也有研究表明，A的損傷作用是 AD 發(fā)生發(fā)展的首要因素11。本研究用 A1-42 處理來源于人類的

21、SH-SY5Y 神經(jīng)細(xì)胞，模擬 AD 患者腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞的病理過程，以此作為燈盞細(xì)辛體外研究的類 AD 細(xì)胞模型。研究結(jié)果顯示，與對照組相比，A1-42 處理組 SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞的 MTT 還原率明顯降低，進(jìn)一步證實 A- 可引起神經(jīng)細(xì)胞的損傷。實驗還發(fā)現(xiàn)，燈盞細(xì)辛預(yù)處理的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞能夠?qū)笰引起的MTT 還原率降低，進(jìn)一步表明該中藥具有抗 A細(xì)胞毒性的作用。    神經(jīng)型尼古丁受體是神經(jīng)系統(tǒng)中一類非第2信使介導(dǎo)性神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合的離子通道，與學(xué)習(xí)和記憶關(guān)系密切，是一類明確的具有神經(jīng)保護(hù)功能的受體，其減少與 AD 的發(fā)生有關(guān)12。AD 病人腦內(nèi)尼古丁受

22、體-配體結(jié)合率降低，其亞基的蛋白表達(dá)水平也降低13。目前尋找可上調(diào) nAChR 且副作用小的藥物是治療AD藥物研究的方向之一。在SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞中，a3 和 a7 是主要的尼古丁受體亞類。本研究中，通過測定nAChR 3 和 7 亞單位蛋白質(zhì)水平發(fā)現(xiàn)，燈盞細(xì)辛乙醇提取物能夠明顯地上調(diào) 3 和7 nAChRs 蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，說明在治療 AD 藥物的選擇中燈盞細(xì)辛可能具有重要的作用。    ChE能通過水解膽堿而發(fā)揮生理功能。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的AChE及膽堿能受體參與完成神經(jīng)與神經(jīng)之間動作電位的傳遞過程，AChE能迅速水解乙酰膽堿（Acetylcholine，A

23、ch）生成膽堿和乙酸，發(fā)揮終止神經(jīng)沖動傳遞的作用5。近幾年的研究表明，AChE和BuChE在AD的發(fā)病過程中起著重要的作用，它們的水解底物ACh缺失的嚴(yán)重程度與癡呆密切相關(guān)14。AD病人腦中總體的AChE活性下降，然而在老年斑中以及其周圍AChE活性卻是升高的。迄今為止，在AD的治療上，世界上最為成熟和成功的方法是采用膽堿酯酶抑制劑（ChEI），以提高患者腦內(nèi)ACh的水平、補償膽堿能功能的缺失。但是，膽堿酯酶抑制劑只能緩解AD患者的臨床癥狀，無法達(dá)到根治的目的。本研究表明燈盞細(xì)辛乙醇提取物乙酸乙酯部位能降低細(xì)胞AChE活性，這說明了其可能具有類似膽堿酯酶抑制劑的功能。對于AD的治療可能具有一定

24、的作用。    綜上所述，燈盞細(xì)辛具有上調(diào) 3，7 nAChR 亞單位蛋白質(zhì)表達(dá)的作用；可抑制細(xì)胞乙酰膽堿酯酶活性；燈盞細(xì)辛在細(xì)胞整體水平有抗 A 的神經(jīng)細(xì)胞毒性作用；其作用機制可能與其刺激 nAChR 表達(dá)有關(guān)，燈盞細(xì)辛可能在 AD 的治療中發(fā)揮重要作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 官志忠, 齊曉嵐. 阿爾茨海默病的分子發(fā)病機制及其治療研究及進(jìn)展J.中華病理學(xué)雜志. 2008, 37(1):11.2 Nordberg A. Nicotinic receptor abnormalities of Alzheimer's disease: therapeu

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