白膜法手工富集血小板與單供者機(jī)采血小板質(zhì)量對(duì)比研究

1、白膜法手工富集血小板與單供者機(jī)采血小板質(zhì)量對(duì)比研究    【摘要】 本研究旨在對(duì)比白膜法手工富集血小板與單供者機(jī)采血小板的質(zhì)量差異。將15袋（2單位/袋，400 ml全血制備）白膜法手工富集血小板和15單位單供者機(jī)采血小板在（22 ±2 ）條件下振蕩保存。在制備后1小時(shí)檢測(cè)血小板濃度、體積、白細(xì)胞殘留量、紅細(xì)胞殘留量；分別在血小板保存的0、1、2、3、4、5天檢測(cè)平均血小板體積、pH值、乳酸濃度、血小板膜表面CD62p表達(dá)率、凝血酶激活后CD62p再表達(dá)率、血小板低滲休克反應(yīng)。結(jié)果顯示：二組的血小板得率、紅細(xì)胞殘留量、白細(xì)胞殘留量都分別達(dá)到相應(yīng)

2、的國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但在達(dá)到相同血小板計(jì)數(shù)的情況下，白膜法手工富集血小板組的紅細(xì)胞殘留量、白細(xì)胞殘留量明顯高于單供者機(jī)采血小板組（p0.01）；二組的乳酸、血小板膜表面CD62p表達(dá)率均隨保存時(shí)間延長(zhǎng)而升高；二組間比較，白膜法手工富集血小板組CD62p表達(dá)率在保存0-5天均高于單供者機(jī)采血小板組（p0.01）。二組的pH值、凝血酶激活后CD62p再表達(dá)率均隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)而下降；二組間比較，2-5天白膜法組pH值明顯低于單供者機(jī)采血小板組（p0.01），0-5天白膜法組CD62p再表達(dá)率明顯低于單供者機(jī)采血小板組（p0.01）。單供者機(jī)采血小板組血小板低滲休克反應(yīng)水平在0-5天無(wú)明顯變化，而白膜法

3、手工富集血小板組血小板低滲休克反應(yīng)水平隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，保存1-5天時(shí)均明顯低于單供者機(jī)采血小板組（p0.01）。結(jié)論：白膜法手工富集血小板質(zhì)量低于單供者機(jī)采血小板質(zhì)量，其制備工藝有待改進(jìn)和優(yōu)化，以降低紅細(xì)胞、白細(xì)胞殘留量和活化血小板水平，提高其血小板質(zhì)量。    【關(guān)鍵詞】 單供者機(jī)采血小板    Qualitative Comparison between Buffy?Coat?Collected Platelet Concentrates and those by Single?donor Platel

4、etapheresis    Abstract    This study was aimed to compare the difference of quality between buffy?coat?collected platelet concentrates (BC?PC) and single?donor plateletapheresis (SDP). 15 packs of BC?PC and 15 units SDP were stored at 20-24 with agitation. Pl

5、atelet concentration， platelet volume, residual leukocyte and residual erythrocyte in two groups were examined after preparation for 1 hour. Mean platelet volume, pH value, hypotonic shock response (HSR) , CD62p expression and CD62p re?expression of platelet were detected on 0, 1, 2, 3, 4, 5 days of

6、 platelet preservation. The results showed that the platelet yields, residual leukocyte and residual erythrocyte in two groups accorded with the national quality standard respectively, but residual leukocyte and residual erythrocyte in BC?PC group were higher than those in SDP group when platelet yi

7、elds in two groups were equal（p0.01）. Lactate concentration, CD62p expression of platelet increased with prolongation of preseved time, while pH value decreased gradually. Compared with SDP group, there were significant differences in CD62p expression, CD62p re?expression of platelet preserved for 0

8、-5 days（p0.01）, and in pH value of platelet preserved 2-5 days（p0.01）.There was no changes in HSR of SDP group for 0-5 days, while HSR in BC?PC group decreased gradually. There were significant differences in HSR of platelet preserved for 1-5 days（p0.01）. It is concluded that the platelet concentrat

9、es prepared by BC?PC are not equal to SDP in quality, the preparation technology of BC?PC should be optimized further in order to reduce residual leukocyte, residual erythrocyte and activated platelet yields, as well as improve the quality of BC?PC.    Key words   

10、 single?donor plateletpheresis; buffy coat; hypotonic shock response; CD62p    J Exp Hematol 2007; 15(4):878-881    隨著全自動(dòng)血細(xì)胞分離機(jī)在國(guó)內(nèi)的普及推廣，我國(guó)單供者機(jī)采（單采）血小板的用量逐年上升，而手工白膜采集的血小板在臨床的應(yīng)用越來(lái)越少，造成手工采集全血中血小板資源的嚴(yán)重浪費(fèi)。而在歐洲，手工采集的血小板始終占血小板用量的大多數(shù)。    國(guó)家衛(wèi)生部

11、決定自2006年9月30日起，一律停止有償單采血小板。因此臨床供應(yīng)的單采血小板數(shù)量顯著下降，手工制備濃縮血小板的用量穩(wěn)步上升。目前國(guó)內(nèi)多數(shù)血站提供的濃縮血小板是采用白膜法手工制備，我們對(duì)白膜法手工富集血小板與單采血小板的質(zhì)量與保存效果進(jìn)行對(duì)比研究，為改進(jìn)手工采集濃縮血小板工藝和建立全面質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。    主要儀器與應(yīng)用試劑    MCS 血細(xì)胞分離機(jī)和995E采集保存袋（美國(guó)血液技術(shù)公司產(chǎn)品），四聯(lián)血液采集保存袋（廣州華南醫(yī)療用品有限公司產(chǎn)品），Heraeus 6000i 低溫離心機(jī)（德國(guó)賀利氏儀器公司產(chǎn)品）

12、，MEK?6180 K 型血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（日本Nikonkohden 公司產(chǎn)品）,VITROS 950干化學(xué)全自動(dòng)生化分析儀(美國(guó)強(qiáng)生公司產(chǎn)品)，F(xiàn)ACSCalibur 流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson產(chǎn)品) 和CellQuest 分析軟件，APACT2聚集儀（四川美生實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品），血小板振蕩保存箱（美國(guó)Forma公司產(chǎn)品），HI9321 微電腦型pH 計(jì)(Hanna 公司產(chǎn)品)，37恒溫水浴箱（北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠產(chǎn)品），Negeotee 血細(xì)胞計(jì)數(shù)池（Hausser Scientific Horsham, USA產(chǎn)品）,普通光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司產(chǎn)品）。抗CD

13、61 抗體: PerCP 標(biāo)記(Becton Dickinson產(chǎn)品)；抗CD62p 抗體: RPE 標(biāo)記( PharMingen公司產(chǎn)品)；人凝血酶: 0.5 U/ ml (Sigma公司產(chǎn)品)； Gly?Pro?Arg?Pro 乙酸鹽( GPRP) : 25 mmol/ L ( Sigma 公司產(chǎn)品)；改良TBS緩沖液: (NaCl 137 mmol/ L; KCl 2. 8 mmol/ L; MgCl21 mmol/L; NaHCO3 12 mmol/ L)； HEPES液1 mol/L。    血小板的制備與保存   

14、; 選擇符合國(guó)家獻(xiàn)血標(biāo)準(zhǔn)的健康獻(xiàn)血者30名，外周血血小板計(jì)數(shù)均大于1.5×1011/L，采血前1周未服用阿司匹林、消炎痛等已知對(duì)血小板功能有影響的藥物，其中15名使用四聯(lián)血袋(ACD?B抗凝劑)采集全血400 ml。全血在采集后的6小時(shí)內(nèi)制備成濃縮血小板。制備流程：使用Heraeus 6000i 低溫離心機(jī)，第1次 1861×g 離心16分鐘，把上層血漿分出200 ml至血漿袋，分約50 ml血漿至轉(zhuǎn)移袋，再擠出20 ml混有紅細(xì)胞的白膜層，血漿沖管至終體積約90 ml；第二次 391×g 離心6分鐘；分出上層富血小板血漿50-70 ml（記為2單位）至

15、第四聯(lián)袋（PVC血小板專用保存袋），下層紅細(xì)胞丟棄。另15名獻(xiàn)血者使用MCS 血細(xì)胞分離機(jī)、995E保存袋采集血小板和ACD?A抗凝劑，單采容量為250-270 ml，血小板記數(shù)大于2.5×1011/單位。將所得濃縮血小板和單采血小板均置于血小板振蕩保存箱內(nèi)，于22±2振蕩保存，振蕩頻率為60次/分鐘。    樣本的制備和處理    將濃縮血小板和單采血小板輕搖混勻后，在無(wú)菌操作臺(tái)上留取樣品至2支塑料試管中；將其中1支試管以 1007×g 離心10分鐘后取其上清液即為乏血小板血漿（PP

16、P），用PPP與另一支試管中的血小板以（1-3）1的比例混合配制成濃度為（3-4）×1011/L的富血小板血漿（PRP）待用。    血小板產(chǎn)品中的血小板、紅細(xì)胞測(cè)定    將稀釋后PRP混勻后用MEK?6180 K型血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定血小板量、MPV及RBC。實(shí)際血小板數(shù)= 血小板計(jì)數(shù)/ L ×稀釋倍數(shù) ×血小板容量(L)；每袋血小板中紅細(xì)胞數(shù)=紅細(xì)胞計(jì)數(shù)/ L ×稀釋倍數(shù) ×血小板容量(L)。    血小板產(chǎn)品的白細(xì)胞計(jì)數(shù)&

17、#160;   用Negeotee血細(xì)胞計(jì)數(shù)池計(jì)數(shù)白細(xì)胞, 取100 l混勻的血小板樣品與400 l白細(xì)胞稀釋液混合10分鐘,充池,然后將計(jì)數(shù)池置于附濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)加蓋,靜置20分鐘后將計(jì)數(shù)池置于200倍雙目顯微鏡下計(jì)數(shù)白細(xì)胞。每袋血小板中白細(xì)胞混入量= 白細(xì)胞數(shù)/ L ×血小板容量。    pH值、乳酸的測(cè)定    采用無(wú)菌注射器留取血小板樣品2 ml，1 ml立即上HI9321微電腦型pH 計(jì)測(cè)定pH值，而另1 ml用VITROS 950干化學(xué)全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定乳酸濃

18、度。    低滲休克反應(yīng)測(cè)定（HSR）1，2    APACT2聚集儀開(kāi)機(jī)、預(yù)溫, 將等滲PBS 緩沖液和低滲去離子水置于聚集儀預(yù)溫孔內(nèi)預(yù)溫。使用HI9321 微電腦型pH 計(jì)測(cè)定PRP的pH之后，并用1.0 mol/L的HEPES液調(diào)節(jié)PRP的pH約為7.0。預(yù)溫完成后，在1測(cè)試杯中加入200 l PPP, 置于測(cè)試孔中設(shè)定PPP值后取出, 在另1測(cè)試杯中加入200 l PRP, 放入攪拌棒后插入測(cè)試孔中設(shè)定完P(guān)RP值后, 取200 l 等滲PBS 緩沖液迅速注入此測(cè)試杯中, 立即啟動(dòng)檢測(cè), 并記錄聚集儀在0.

19、5分鐘時(shí)的透光率，記為TPBS; 用低滲去離子水代替等滲PBS 緩沖液重復(fù)以上操作, 并記錄凝集儀在4分鐘內(nèi)的最大透光率及4分鐘時(shí)的透光率，分別記為TMAX和T4min。    HSR=（TMAX-T4 min）/（TMAX-TPBS）×100%    血小板CD62p的陽(yáng)性率與凝血酶激活后CD62p再表達(dá)率測(cè)定    在FCM專用試管中依次加入PRP，2.5 mmol/ L的GPRP、CD61、CD62p 各5 l，TBS 35 l，輕輕搖勻后室溫避光孵育15分鐘

20、；CD62p再表達(dá)率測(cè)定時(shí)，在加入CD62p之前需加入0.5 U/L的人凝血酶，混勻后再加CD62p 5 l，TBS 30 l，37避光孵育15分鐘。加入4 1%的多聚甲醛500 l，避光固定15分鐘，24小時(shí)內(nèi)進(jìn)行FCM分析。對(duì)照設(shè)定：?jiǎn)渭冄“鍖?duì)照，單染PerCP標(biāo)記抗CD61抗體對(duì)照，單染RPE標(biāo)記抗CD62p抗體對(duì)照，用于調(diào)補(bǔ)償。CD62p再表達(dá)率=凝血酶激活后CD62p的陽(yáng)性率-CD62p的陽(yáng)性率。    統(tǒng)計(jì)學(xué)處理    所得數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，各參數(shù)差異比較用配對(duì)t

21、檢驗(yàn)。    結(jié)    果    兩組血小板制備后常規(guī)質(zhì)量指標(biāo)檢測(cè)    結(jié)果見(jiàn)表1。兩組血小板均分別達(dá)到了國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。12單位手工制備濃縮血小板相當(dāng)于1單位單采血小板，血小板總數(shù)與單采血小板組比較無(wú)顯著差異（p0.05），而白細(xì)胞殘留總數(shù)、紅細(xì)胞殘留總數(shù)、血小板總?cè)萘棵黠@高于單采血小板組（p0.01）。    兩組血小板液態(tài)保存過(guò)程中代謝、功能指標(biāo)的變化   &#

22、160;結(jié)果見(jiàn)表2。隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組的乳酸濃度均逐漸增高，pH值逐漸下降；2組間比較，0-5天乳酸濃度均無(wú)顯著差異，0-1天pH值無(wú)顯著差異，2-5天白膜法組pH值低于單采血小板組（p0.01）。2組的MPV均隨保存時(shí)間延長(zhǎng)而增大，在0-4天兩組間無(wú)顯著差異，第5天白膜法手工富集血小板組的MPV明顯高于單采血小板組（p0.05），單采血小板在整個(gè)保存期間HSR無(wú)明顯變化，白膜法手工富集血小板組第2天開(kāi)始出現(xiàn)明顯下降，與單采血小板組比較差異顯著（p0.01）。隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)，CD62p表達(dá)率不斷升高，CD62p再表達(dá)率不斷下降，2組間比較差異顯著（p0.01）。  

23、  討    論    單采血小板的國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為每單位單采血小板的血小板計(jì)數(shù)2.5×1011，白細(xì)胞混入量5×108，紅細(xì)胞混入量8×109；手工制備濃縮血小板血小板計(jì)數(shù)4.0×1010（2單位/400毫升全血制備），白細(xì)胞混入量5×108，紅細(xì)胞混入量2×1093。本實(shí)驗(yàn)中的單采血小板與手工制備濃縮血小板均達(dá)到了相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但按照血小板計(jì)數(shù)計(jì)算，輸注12單位手工制備濃縮血小板才相當(dāng)1單位單采血小板，而紅細(xì)胞殘留總數(shù)、白細(xì)胞殘留總

24、數(shù)、血小板容量則明顯要高于單采血小板（p0.01），引起輸血不良反應(yīng)的幾率可能也會(huì)相應(yīng)增大。    血小板在體外液態(tài)保存過(guò)程中，新陳代謝活動(dòng)仍在不斷進(jìn)行中，主要包括有氧代謝和糖酵解兩種途徑4。血小板的能量供應(yīng)主要源于有氧代謝，其代謝終產(chǎn)物二氧化碳可以通過(guò)血小板保存袋擴(kuò)散出去。糖酵解的終產(chǎn)物是乳酸和氫離子，無(wú)法通過(guò)保存袋擴(kuò)散，氫離子被血漿中的碳酸氫鹽緩沖，但當(dāng)乳酸達(dá)到20 mmol/L時(shí)，血漿的緩沖作用消失，導(dǎo)致pH值迅速下降5。因此，pH值作為血小板質(zhì)量監(jiān)控的一項(xiàng)重要指標(biāo)而被大多數(shù)血液機(jī)構(gòu)采用。本研究中兩組血小板的pH值均隨保存時(shí)間延長(zhǎng)而下降，但白膜法手

25、工富集血小板組pH值下降更明顯（p0.01），因而可能對(duì)其體外功能產(chǎn)生不利影響。    血小板CD62p，也稱P選擇蛋白，是血小板活化的重要標(biāo)志物之一，CD62p表達(dá)率是目前可以有效預(yù)測(cè)血小板體內(nèi)回收率和存活率的最佳指標(biāo)6,7。歐陽(yáng)錫林等8研究表明，凝血酶激活后CD62p再表    達(dá)率可以有效反應(yīng)血小板保存過(guò)程中功能儲(chǔ)備的變化情況。本研究同時(shí)對(duì)兩種方法制備血小板制備后及保存過(guò)程中CD62p表達(dá)率及凝血酶激活后CD62p再表達(dá)率進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，結(jié)果隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)，CD62p表達(dá)率不斷升高，CD62p再表達(dá)率不斷下降，

26、究其原因可能主要是血小板儲(chǔ)存損傷所致。但白膜法手工富集血小板組CD62p表達(dá)率的基礎(chǔ)值明顯高于單采血小板組，而CD62p再表達(dá)率基礎(chǔ)值明顯低于單采血小板組，其原因可能是白膜法制備濃縮血小板過(guò)程中2次離心、擠壓白膜等制備工序造成血小板過(guò)度激活所致。    HSR是能反映血小板體內(nèi)存活率的重要功能指標(biāo)1，HSR的恢復(fù)率越高，血小板的形態(tài)與體積就越接近正常，血小板的功能就越好。本研究中兩組的MPV均隨保存時(shí)間延長(zhǎng)而增大，在0-4天兩組間無(wú)顯著差異，第5天白膜法手工富集血小板組的MPV明顯高于單采血小板組；單采血小板在整個(gè)保存期間HSR無(wú)明顯變化，而在白膜法手工富集血小板組第2天開(kāi)始出現(xiàn)明顯下降，與單采血小板組比較差異顯著。HSR的變化間接反映了血小板膜耗能被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)能力的變化，受保存介質(zhì)中能量代謝水平、pH值的影響。pH值的下降可能造成能量代謝及血小板膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)酶活性下降，從而使血小板HSR能力降低。    綜上所述，白膜法手工富集血小板質(zhì)量低于單采血小板質(zhì)量，其制備工藝尚需進(jìn)一步改進(jìn)和提高，以降低紅細(xì)胞、白細(xì)胞的殘留率和活化血小板水平，全面提高手工制備濃縮