關(guān)于中藥血清藥理學(xué)方法的再思考

1、關(guān)于中藥血清藥理學(xué)方法的再思考        摘 要：血清的形成與凝血及其相關(guān)過程（纖溶與補體系統(tǒng)活化）的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)以及血小板和白細(xì)胞活化有關(guān)，這些過程直接影響血標(biāo)本的組成，并可能也影響中藥成分；但這些過程可用抗凝劑而加以避免。因此，血漿的組成較血清能更好地反映生理、病理狀況和吸收進(jìn)入循環(huán)血中藥物變化。根據(jù)已有報道，藥物濃度與反應(yīng)物質(zhì)在血漿與血清中可能存在差異，故倡導(dǎo)在中藥半體內(nèi)實驗中采用血漿藥理學(xué)方法。由于不同抗凝劑的作用機(jī)制各異，究竟哪一抗凝劑適用于哪類半體內(nèi)實驗，需要進(jìn)一步開展研究。我們建議在大多數(shù)中藥半體內(nèi)實驗中

2、，可以采取含藥血漿與含藥血清平行觀察，除非事先對該試驗的干擾已有充分了解。關(guān)鍵詞：中藥 血清藥理學(xué) 血漿藥理學(xué)/方法        半體內(nèi)實驗盡管藥物的療效與毒副反應(yīng)的確定主要依賴整體（in vivo）試驗，但為闡明藥物的藥理與毒理作用及其機(jī)制，通常還需借助體外（in vitro） 與半體內(nèi)(exvivo)實驗。血清藥理學(xué)方法屬于半體內(nèi)實驗。關(guān)于這一方法，我們在研究生教材中早已提出異議。三年前，我們又在中國藥理學(xué)通報上發(fā)表了質(zhì)疑血清藥理學(xué)的專文。由于這一問題是關(guān)系到中藥藥理能否被國際生物醫(yī)學(xué)界廣泛認(rèn)可的重大問題，故從促進(jìn)中藥

3、藥理學(xué)科發(fā)展出發(fā)，根據(jù)國內(nèi)外的新進(jìn)展，結(jié)合我們自己的工作，再次對血清藥理學(xué)方法進(jìn)行質(zhì)疑，并建議發(fā)展血漿藥理學(xué)方法。一、采用血標(biāo)本進(jìn)行半體內(nèi)實驗的合理性中藥成分復(fù)雜，除有效成分外，還含有非有效成分和雜質(zhì)，甚至毒性成分等。若將中藥粗制品直接加入離體生物反應(yīng)體系，可能導(dǎo)出假陽性或假陰性或相反的結(jié)果。為解決這一困難，模擬臨床常用服藥方式，將中藥給動物灌服，而后間隔一定時間，取血制備血清；以此含有中藥成分的血清進(jìn)行體外實驗，此即血清藥理學(xué)方法。應(yīng)當(dāng)肯定提出這一方法的初衷是合理的?？诜蚬喾兴幒螅M(jìn)入血流的有效成分大致包括六個來源：中藥天然原形成分；中藥加工與煎煮過程產(chǎn)物；胃腸道對中藥消化分解產(chǎn)物；腸內(nèi)

4、細(xì)菌對中藥代謝產(chǎn)物；體內(nèi)（主要是肝、肺、腎）對中藥生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物；中藥有效成分介導(dǎo)體內(nèi)表達(dá)分泌的活性物質(zhì)。這些成分與物質(zhì)都首先出現(xiàn)或存在循環(huán)血液中，所以采取血標(biāo)本作為半體內(nèi)實驗的原材料，這是合理的。然而，血液包括血細(xì)胞與血漿兩個部分；血清是血液凝固后除去纖維蛋白與16世界科學(xué)技術(shù)中醫(yī)藥現(xiàn)代化血細(xì)胞的液體部分，它有別于血漿。因為凝血及其繼發(fā)的一系列生物學(xué)反應(yīng)不僅明顯改變了血液成分，而且對中藥成分與其派生物質(zhì)可能產(chǎn)生影響。由此可知，采用血清藥理學(xué)方法得出的實驗結(jié)論不一定都是可靠的，其中可能存在假陽性和假陰性問題。對于血標(biāo)本的應(yīng)用，臨床檢驗通常根據(jù)不同項目，分別采用血清、血漿和全血。世界衛(wèi)生組織（WH

5、O）2002 年“關(guān)于血標(biāo)本選擇專題報告”中指出：“由于歷史的緣故，過去通常采用血清；現(xiàn)在許多實驗室傾向于采用血漿。因為凝血引起的級聯(lián)與相關(guān)反應(yīng)可用抗凝劑加以避免，顯然血漿的組成較血清能更好地反映體內(nèi)的實際情況。在該報告的推薦項目中，血清 6 項，血漿 57 項，抗凝全血 41 項。然而在我國已有的中藥藥理報道中，以血標(biāo)本作為半體內(nèi)實驗原材料，幾乎都是采用含藥血清，這種“一邊倒”的現(xiàn)象是不合理的畸形發(fā)展。血清藥理學(xué)方法首先由日本田代真一于 1984 年提出。我國 1995 年起開始有關(guān)中藥血清藥理學(xué)研究的報道。隨后在國家自然科學(xué)基金會與國家中醫(yī)藥管理局的資助下，有關(guān)中藥血清藥理學(xué)方面論文逐年上

6、升，目前處于高峰平臺期。由于血清藥理學(xué)方法得到的實驗結(jié)論存在不確定性，故這種畸形發(fā)展趨向可能給中藥的研究與開發(fā)帶來嚴(yán)重的不利后果。二、血清與血漿差異的多樣性在體外實驗中，全血指抗凝的血液，血漿指抗凝血液離心后去除血細(xì)胞的上清液，血清指凝血完成后未稀釋的細(xì)胞外液，三者存在明顯的差別。一般認(rèn)為血清是無纖維蛋白原的血漿，這是不正確的。隨著生物科技進(jìn)步，特別是蛋白組學(xué)與肽組學(xué)飛速發(fā)展，現(xiàn)已明確凝血過程涉及多方面的改變，主要包括：凝血過程中多個絲氨酸蛋白酶原和輔因子被活化，并釋放一些激活肽和碎片。血中多種抗凝蛋白因子與凝血過程中絲氨酸蛋白酶結(jié)合而減少，同時由此生成的酶-酶抑制物復(fù)合物增加。接觸激活促使纖

7、維蛋白溶解系統(tǒng)活化，除引起纖溶酶-纖溶酶抑制物復(fù)合物形成外，還涉及一系列大小不等的纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物生成。接觸激活還能觸發(fā)激肽與補體系統(tǒng)的級聯(lián)反應(yīng)，從而產(chǎn)生一系列激肽和活化的補體成分，其中部分激肽與活化補體成分具有明顯的生物活性。絲氨酸蛋白酶（凝血酶、FXa 等）通過與相應(yīng)受體結(jié)合，強烈刺激血小板，致密體與致密管道可釋放多種低分子物質(zhì)； 顆粒釋放大量蛋白質(zhì)，除涉及凝血與纖溶蛋白外，還含有多種生長因子（如 PDGF、VEGF、EGF、CTAP、TGF- 等）。新近報道凝血酶激活的血小板分泌組（secreteome）包括 300 余種蛋白。凝血酶等絲氨酸蛋白酶通過蛋白酶激活受體（PAR）刺激白

8、細(xì)胞，除表達(dá)多種促炎因子（如TNF，IL-6，MCP-1 等）外，還釋放多種溶酶（如彈性蛋白酶、組織蛋白酶等），這些溶酶又可引起許多復(fù)雜反應(yīng)。凝血過程也刺激紅細(xì)胞，使之代謝活躍，并引起細(xì)胞膜通透性增高，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外移；這些改變隨著血清與凝塊接觸時間延長而加劇。凝血酶刺激中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致大量活性氧生成，同時血小板釋放 NO，引起血中過氧化物增加，抗氧化物質(zhì)因消耗而減少。完全的凝血過程通常刺激并損傷血細(xì)胞，致使血清中 RNA 和 DNA 在 6h 以內(nèi)不斷增加。凝血酶、纖溶酶和溶酶可能降解血中部分蛋白及肽類生物活性物質(zhì) （如 ACTH、PTH、IL-7、IL-10等）。據(jù)報道二維凝膠電泳顯示血

9、清與血漿差異蛋白約 53 個，其中僅出現(xiàn)在血清中的有 9 個。肽組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在 MALDI-MS/MS 實驗中，血清中質(zhì)譜信號約30007000，其中 40%以上僅出現(xiàn)于血清中，并不見于血漿?？傊?，血清與血漿存在多種多樣的差異。所以，為反映體內(nèi)的實際情況，越來越多學(xué)者主張在醫(yī)學(xué)研究與臨床檢驗中，特別是蛋白組學(xué)、肽組學(xué)與代謝組學(xué)研究，最好采用血漿，只有在抗凝劑干擾檢驗結(jié)果的情況下，才考慮采用血清。三、血清藥理實驗結(jié)論的不確定性引起血清藥理實驗結(jié)論的不確定原因主要有以下四點：1. 血清藥理不能反映體內(nèi)真實過程由于一般人群和絕大多數(shù)病人體內(nèi)并未發(fā)生嚴(yán)重的彌散性血管內(nèi)凝血，循環(huán)血液中的非細(xì)胞部分是血漿

10、，而不是血清。因此，病人口服或給動物灌服中藥后，被胃腸道吸收的中藥成分及其派生物質(zhì)是進(jìn)入血漿，并非血清。也就是說，含藥血漿能夠較好地反映體內(nèi)血液實際情況，含藥血清不能代表體內(nèi)實際情況。2. 含藥血清不一定正確反映中藥有效成分（1）在制備血清過程中中藥成分可能發(fā)生明顯變化。因為有些成分可能與纖維蛋白或/與血細(xì)胞吸附或結(jié)合，有些可能與其他蛋白結(jié)合。在去除纖維蛋白和血細(xì)胞時，必然導(dǎo)致部分中藥成分和中藥介導(dǎo)的體內(nèi)釋放的某些活性物質(zhì)損失。（2）凝血與纖溶過程產(chǎn)生的酶、粒細(xì)胞和血小板釋放的溶酶（包括降解蛋白、糖、脂質(zhì)、核苷酸）以及活化補體成分（如 C1r，C1s，C2 等）等酶類物質(zhì)高達(dá)數(shù)十種，它們可能使

11、某些中藥成分和它們介導(dǎo)的體內(nèi)活性物質(zhì)受到降解從而降低或喪失藥效。（3）由凝血及其相關(guān)過程產(chǎn)生的酶類也可能使中藥某些無作用的原形成分，經(jīng)過分解而產(chǎn)生一定的生物活性。以上情形不可能發(fā)生于一般人群和絕大多數(shù)病人體內(nèi)。所以，含藥血清不一定正確反映中藥有效成分的生物活性。3. 含藥血清與未含藥血清不具可比性對照是實驗設(shè)計的首要原則。對照就是要求實驗組與對照組除處理因素不同外，其他條件齊同可比，保證組間非處理因素（包括可控和非可控的）所產(chǎn)生的效應(yīng)基本相同。只有這樣，才是有效對照。由于許多中藥（特別是與中醫(yī)“氣”、“血”相關(guān)的藥物）可能通過不同作用環(huán)節(jié)，對凝血、纖溶、補體及激肽系統(tǒng)產(chǎn)生不同的影響。有些中藥成

12、分可能對血小板與白細(xì)胞也具有一定的作用。這些差異就會造成含藥血清與未含藥血清的凝血及其相關(guān)過程反應(yīng)不同。在這種情況下，含藥血清的非處理因素引起的效應(yīng)與未含藥的對照血清往往缺乏齊同可比性。也就是說，非處理因素效應(yīng)與處理因素效應(yīng)的差異混雜在一起，容易造成實驗結(jié)論的不確定性。例如實驗?zāi)康氖抢冒塍w內(nèi)實驗篩選促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的中藥。若該藥確有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長作用，但同時也有一定抗凝作用，則由于凝血酶生成量減少，血小板釋放的生長因子（PDGF，VEGF）降低；如用這種含藥血清與未含藥血清相比，可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果。若該藥確無促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖使用，但它具有一定促凝作用，則凝血酶生成量增加，血小板釋

13、放的生長因子增多；如用這種含藥血清與未含藥血清相比，可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。4. 血清預(yù)處理可能帶來新的干擾由于凝血及其相關(guān)過程（纖溶、激肽、補體系統(tǒng)與血小板及白細(xì)胞活化），血清呈現(xiàn)多種生物活性。就凝血酶與其它絲氨酸蛋白酶而言，必須在 3746h 或 424h 以上，其活性才會基本喪失。否則，這些絲氨酸蛋白酶通過蛋白酶活化受體（PAR）除刺激血細(xì)胞外，還可直接激活半體內(nèi)實驗中靶細(xì)胞（如血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞、腎小管細(xì)胞、腦膠質(zhì)細(xì)胞等）。故以混合新鮮血清或經(jīng)-40保存新鮮血清進(jìn)行半體內(nèi)實驗顯然是不妥的。至于采用丙酮、乙醇沉淀或加熱處理血清，并不是特異性滅活補體與酶類，同

14、時也會對中藥成分和其介導(dǎo)的生物活性物質(zhì)（尤是蛋白質(zhì)與肽類）造成損失或滅活。新近報道使用 ELISA 方法，以 100 個血漿蛋白為指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱處理（561h）使 31 個蛋白含量顯著降低，其中 MIP-1 與 AMG2 完全喪失，同時有 5 個蛋白反而升高；以 80 個可溶性蛋白為指標(biāo)，熱處理血清有 11 個蛋白顯著高于熱處理血漿，另有 8 個蛋白低于熱處理血漿。至于熱處理造成血漿中某些蛋白反而增高，這是由于殘存血細(xì)胞裂解所致；因血漿較血清殘留血細(xì)胞較多，故熱裂解釋放的細(xì)胞內(nèi)蛋白也多一些。由此可見，預(yù)處理將會給實驗帶來一些新的干擾因素。四、含藥血漿可行性及其與含藥血清的比較鑒于血清與血漿存

15、在多方面差別，為盡量反映體內(nèi)實際情況，在藥代動力學(xué)研究中，絕大多數(shù)采用血漿；只有在抗凝劑干擾實驗結(jié)果的情況下，才考慮采用血清。這已是學(xué)術(shù)界公認(rèn)的原則。同理，與含藥血清相比，含藥血漿避免了凝血及其相關(guān)過程對實驗的影響，因此，大多數(shù)中藥的半體內(nèi)實驗也應(yīng)當(dāng)采用血漿藥理學(xué)方法；而血清藥理學(xué)方法僅適用于抗凝劑可能干擾實驗結(jié)果的研究。關(guān)于含藥血漿可行18世界科學(xué)技術(shù)中醫(yī)藥現(xiàn)代化性以及含藥血清與含藥血漿的異同，國內(nèi)外研究已取得了一些重要進(jìn)展，主要集中在以下幾個問題：1. 采用血漿能夠反映中藥入血情況國內(nèi)中藥研究工作者成功地利用血漿對中藥有效成分含量、蛋白結(jié)合率、代謝產(chǎn)物與中藥藥代動力學(xué)進(jìn)行多種實驗。然而，由

16、于歷史的緣故，長期以中藥中的一個或少數(shù)幾個代表性成分說明中藥的藥效。前已指出，中藥入體后進(jìn)入循環(huán)血液的有效成分除原形成分外，還可能存在其他五個來源。中南大學(xué)中藥現(xiàn)代化研究中心采用 LC-DAD-APCI-MS聯(lián)用指紋圖譜，對兔灌服當(dāng)歸口服液進(jìn)行前后對比觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)灌藥后血漿中出現(xiàn)與口服液中原形成分相同的有 32 個，另有 10 個以上成分僅見于含藥血漿。2. 含藥血漿與血清中藥物濃度不盡相同根據(jù)有關(guān)口服或灌服后血漿與血清藥物含量比較的報道，大體分為三種情況：血漿藥物濃度高于血清，如氯氮平、丙咪嗪。血清藥物濃度高于血漿，如慶大霉素、妥布霉素等。血漿與血清藥物濃度接近，如 voriconazol

17、e、苯巴比妥等。關(guān)于血漿與血清中藥物濃度不同的具體機(jī)制并未完全闡明。血清藥物濃度低于血漿者，可能與纖維蛋白吸附、凝血及相關(guān)過程釋放的酶類降解以及結(jié)合蛋白構(gòu)象改變使結(jié)合率增高有關(guān)。血清藥物濃度高于血漿者，可能與凝血及相關(guān)過程導(dǎo)致藥物和蛋白結(jié)合率降低、抗凝劑引起結(jié)合反應(yīng)增強以及抑制血細(xì)胞釋放或解離有關(guān)。凡不受凝血及相關(guān)過程和抗凝劑影響的藥物則血漿與血清中濃度基本相同或接近。有關(guān)中藥成分在血漿與血清中濃度比較報道較少。我們利用 HPLC-MS 指紋圖譜方法對中藥腦泰方進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在質(zhì)譜分析中，EST 電噴霧正離子掃描條件下，含藥血清極性部分成分較該復(fù)方成分顯著減少；在 PDS 紫外掃描條件下，

18、含藥血清中極性部分成分大部分消失或明顯降低，然而含藥血漿仍存在較多的極性成分。新近羅琳等報道將復(fù)方五仁醇膠囊給大鼠灌胃后，以HPLC 法測定其藥效主要成分五味子醇甲和五味子乙素的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿中的兩種藥效成分含量均明顯高于血清。這與的情況相似。據(jù)理推測與兩種情況在中藥服藥后也可能是存在的。3. 含藥血漿與血清的反應(yīng)成分可能存在差別Stroncek 等報道粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）對健康人的反應(yīng)，以 80 個蛋白為觀察指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥前血清中有 20 個高于血漿，24 個低于血漿，血漿與血清接近者為 36 個；連續(xù)給藥 5 天后 2h 取血，血清中 14 個明顯改變，血漿中 15 個

19、明顯改變，其中血清與血漿改變基本相同的為 11 個，但有 3 個僅見于血清，另有 4 個僅見于血漿。然而體內(nèi)實際存在的是血漿，而不是血清。故在此情況下，若僅以血清作為惟一標(biāo)本，就會將僅見于血清的蛋白作為對藥物的反應(yīng)蛋白，則屬假陽性；而未能觀察的僅見于血漿的蛋白，則屬假陰性。既然單純的基因重組藥物的含藥血清與血漿組分并不完全相同，那么成分復(fù)雜的中藥和復(fù)方的含藥血清與血漿也可能存在差異。新近我們利用 HPLC 指紋圖譜方法，對一中藥復(fù)方進(jìn)行對比觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白血漿相比，含藥血清具有 8 個特征成分峰，其中 4 個與含藥血漿共有，另 4 個峰僅見于含藥血清。這些事實表明含藥血清與含藥血漿在組成成

20、分上，既有共同性，也有差異性。4. 含藥血清與血漿的活性也存在差異黃程輝等在研究中藥復(fù)方（拮新康）中，發(fā)現(xiàn)含藥血清濃度在 2.5%10.0%（v/v）范圍內(nèi)，其抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用隨著含藥血清量的增加而增強；但當(dāng)含藥血清濃度高達(dá) 10.0%20.0%范圍時，其抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用隨著含藥血清量的增加反而逐漸減弱，量效曲線呈現(xiàn)“V”形。可是，未含藥血清（對照血清）在 2.5%-20%范圍內(nèi)，隨著血清量增加，促進(jìn)細(xì)胞增殖作用越強。顯然，高濃度含藥血清出現(xiàn)的“反常”現(xiàn)象可能是由于血清本身促增殖作用造成的。因此，血清本身的生物活性可能明顯地干擾了中藥的藥理效應(yīng)。王東生等對大黃蟅蟲丸含藥血漿與血清進(jìn)行比

21、較，發(fā)現(xiàn)含藥血漿抑制血小板聚集作用顯著優(yōu)于含藥血清。新近賀龍剛等對丹參注射液的含藥血漿與血清進(jìn)行比較，以雞胚絨毛尿囊膜血管生成為指標(biāo)，結(jié)果表明含藥血漿促血管新生作用顯著強于含藥血清。張兵等報道在觀察復(fù)方五仁醇膠囊保肝作用研究中，也發(fā)現(xiàn)實驗效應(yīng)存在類似的差異。馬琦林等利用血漿藥理學(xué)方法，觀察通心絡(luò)對血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管緊張素刺激下的反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)通心絡(luò)含藥血漿能夠顯著地抑制組織因子和血管緊張素1 型受體的表達(dá)。以上結(jié)果表明中藥血漿藥理學(xué)方法是可行的，并且在一定條件下較血清藥理學(xué)方法更具優(yōu)勢。五、對今后中藥血清與血漿藥理學(xué)方法的思考面對血清藥理實驗結(jié)論的不確定性，而血漿藥理學(xué)方法剛剛處于萌芽階段，那

22、么對于以血標(biāo)本進(jìn)行的半體內(nèi)實驗，今后究竟如何開展才算科學(xué)合理呢？這是一個關(guān)系中藥藥理發(fā)展的重要問題，我們提出以下初步想法。1. 提倡血漿藥理學(xué)方法基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與藥學(xué)科研的目的是為臨床應(yīng)用提供可靠的依據(jù)，盡量保持被試成分與體內(nèi)實際情況一致是務(wù)必遵循的基本原則。與血清相比，由于避免了凝血及其相關(guān)過程引起血中成分的改變，顯然血漿較血清更加接近體內(nèi)循環(huán)血流中液體部分的實際情況。因此，在中藥藥理研究中，凡是可能受到凝血和其相關(guān)過程以及制備血清過程影響的藥理實驗，在選擇血標(biāo)本時應(yīng)當(dāng)選用血漿；凡是使用血清與血漿均可的實驗，應(yīng)當(dāng)優(yōu)先選用血漿。其次，與血清相比，血漿制備簡單，快速省時，且血漿獲取量通常較血清多 15

23、%20%。所以，一般說來，血漿藥理學(xué)方法為首選。2. 開展不同血漿藥理方法適用范圍的研究不同抗凝劑的作用機(jī)制是不同的13，50。乙二胺四乙酸（EDTA）、草酸鹽與枸櫞酸鹽是通過螯合 Ca2+而發(fā)揮抗凝血作用的，其中以 EDTA 螯合力最強，草酸鹽次之，枸櫞酸鹽再次。肝素本身并不抗凝，甚至具有一定的促凝作用，但它與抗凝血酶結(jié)合，可以滅活絲氨酸蛋白酶（凝血酶、FXa、FIXa 等）。水蛭素僅特異性滅活凝血酶。因此，不僅在實驗室檢驗中應(yīng)重視不同抗凝劑的區(qū)別使用，而且在中藥的半體內(nèi)實驗中，抗凝劑的正確選擇同樣是十分重要的。由于Ca2+不僅涉及凝血，而且也與許多其它酶反應(yīng)密切相關(guān)，故螯合 Ca2+可以抑

24、制凝血與多種酶反應(yīng)。因為EDTA 螯合 Ca2+作用最為完全，所以它是目前實驗室應(yīng)用最廣的抗凝劑53。常用的是 Na2EDTA 或 K2EDTA。但 EDTA 幾乎可使細(xì)胞外游離 Ca2+降至零，所以依賴細(xì)胞外 Ca2+的半體內(nèi)實驗不宜選用 EDTA 抗凝，而應(yīng)采用肝素抗凝；若半體內(nèi)實驗對細(xì)胞外 Ca2+依賴程度不高，則可使用枸櫞酸鹽抗凝。其次，肝素是一個多分散帶負(fù)電荷的分子，可與多種蛋白結(jié)合；通過接觸激活，不僅啟動內(nèi)源性凝血上游部分，而且激活補體系統(tǒng)并促進(jìn)激肽生成，故肝素也可能干擾某些中藥的半體內(nèi)實驗。在此情況下，應(yīng)考慮 EDTA 或枸櫞酸鹽抗凝。在體內(nèi)，枸櫞酸屬于三羧循環(huán)產(chǎn)物，螯合Ca2+并不完全，但存在稀釋與易于溶血。水蛭素對凝血過程的抑制限于單個靶點，很少用于半體內(nèi)實驗。實際上，對于中藥藥理研究，究竟何種抗凝劑最適哪類或哪些半體內(nèi)實驗？哪類中藥組分適于何種抗凝含藥血漿？這些都是亟待解決的研究課題。3. 正確對待血清藥理學(xué)問題我們質(zhì)疑血清藥理方法的實驗結(jié)論，并不是全盤否定其研究的合理性，而是提醒其存在不確定性。相反，由于抗凝劑會帶來陽離子沾染，并可能干擾某些酶類或 Ca2+依賴性反應(yīng)，因此，某些中藥的部分半體內(nèi)實驗可能幾種抗凝劑均不宜選用，此時無疑應(yīng)當(dāng)采用血清藥理學(xué)方法。然而，