水溶性凝膠滲透色譜法測定聚乙烯亞胺的分子量及其分布

1、水溶性凝膠滲透色譜法測定聚乙烯亞胺的分子量及其分布劉瑞鵬*，曾憲海，隋國紅，趙金鎧（青島迪愛生精細(xì)化學(xué)有限公司 山東 青島 266101）摘要：應(yīng)用水溶性凝膠滲透色譜法測定了聚乙烯亞胺（PEI）的分子量，測試結(jié)果與廠家提供結(jié)果基本一致。色譜柱為PL aquagel-OH 30, PL aquagel-OH 30和PL aquagel-OH 40三柱串聯(lián)色譜柱組，流動(dòng)相為0.20.3 mol/L 的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH 4.56.0）。系統(tǒng)考察了不同流動(dòng)相及其pH值，離子強(qiáng)度和進(jìn)樣量對(duì)PEI在凝膠柱上吸附等導(dǎo)致的對(duì)分析結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：增大流動(dòng)相離子強(qiáng)度有利于減少PEI的吸附，但流動(dòng)相

2、的pH值對(duì)于PEI的吸附具有更重要的影響。該方法具有優(yōu)良的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。關(guān)鍵詞：水溶性凝膠滲透色譜法，聚乙烯亞胺，分子量及其分布，準(zhǔn)確性，重復(fù)性Determination on Molecular Weight and Distribution of Polyethyleneimine with Aqueous Gel Permeation ChromatographyLIU Ruipeng, ZENG Xianhai, SUI Guohong, ZHAO Jinkai(Qingdao DIC Fine Chemicals Co. LTD Shandong Qingdao 266101)Ab

3、stract：The molecular weight and distribution of polyethyleneimine (PEI) polymers, a series of macromolecular material from Nippon shokubai, was separated by aqueous gel permeation chromatography on PL aquagel-OH 30, PL aquagel-OH 30 and PL aquagel-OH 40 columns and calibrated by universal polyethyle

4、ne glycol standard. The mobile phase was 0.2-0.3 mol/L acetic acid-sodium acetate buffers with pH value of 4.5-6.0. The measured molecular weight was similar to the actual molecular weight given by the manufacturer. The influence of the sorts of mobile phase and its pH value, ionic strength and the

5、injection volume on the adsorption of the samples by the columns were systematically examined. It was found that the pH value and the ion strength of mobile phase affected the accuracy and reproducibility of the results causing mainly by adsorption of PEI greatly. The increases of pH value and ion s

6、trength caused the decrease of adsorption, and moreover, the pH value proved to be a more important factor. The reproducibility of measuring molecular weight and distribution of PEI was controlled within the range of tolerance.Key words：Aqueous Gel Permeation Chromatography, Polyethyleneimine, Molec

7、ular Weight and its Distribution, Accuracy, Reproducibility1 前言聚乙烯亞胺(PEI)是一種廣泛使用的高分子材料，可用作造紙助劑、粘合材料及其助劑、涂料及墨水助劑、紡織助劑和分散劑等。此外，聚乙烯亞胺是1995年發(fā)現(xiàn)的重要的非病毒核酸載體1，由于具有價(jià)格低、操作簡單、安全性高等特點(diǎn)而備受關(guān)注，是目前應(yīng)用最廣泛的非病毒載體之一。聚乙烯亞胺的組成如分子量大小和分布對(duì)其各種應(yīng)用性能有重要影響，但其分子量及其分布測定有許多困難。常用的黏度法，操作步驟繁瑣、誤差高且只能測得粘均分子量Mv，而得不到分子量分布的信息。采用TOF-MALDI方法可以

8、得到低分子量PEI的分子量分布信息，但是該方法對(duì)高分子量PEI響應(yīng)很低，很難得到有價(jià)值的信息。凝膠滲透色譜法（GPC）是簡便快捷的測定多種分子量和分子量分布的有效方法。但是，由于PEI類高分子易和許多商品色譜柱產(chǎn)生吸附，它的凝膠色譜分析并不容易實(shí)現(xiàn)。文獻(xiàn)報(bào)道用四氫呋喃（THF）作流動(dòng)相對(duì)PEI進(jìn)行GPC分析2。然而，PEI樣品在THF中的溶解度極小且在GPC的色譜圖中響應(yīng)值非常低, 很難準(zhǔn)確標(biāo)定它們的分子量。而PEI是水溶性的，利用水溶性GPC更易實(shí)現(xiàn)檢測。Kumoi等人3利用乙醇胺和乙酸水溶液在TSK-Gel 色譜柱G-2000 PW 和G-3000 PW上檢測了PEI高分子的分子量和分子量

9、分布（采用激光光散射器檢測）。Guise等人4在硅膠柱上研究了陽離子聚合物聚酰胺、表氯醇樹脂、聚乙烯亞胺和聚乙烯吡啶的分析，發(fā)現(xiàn)不但pH值、離子強(qiáng)度和色譜柱對(duì)分離結(jié)果影響顯著，鹽的種類和高分子的濃度影響也很大。Kissel等人5利用德國PSS（Polymer Standard Service）公司的Suprema Max 3000色譜柱、以1%甲酸為流動(dòng)相分析PEI類聚合物，但所測得數(shù)均分子量Mn值往往接近重均分子量Mw。利用氨乙基甲基丙烯酸酯色譜柱、普魯蘭多糖為標(biāo)樣，他們又在1%甲酸中分離了PEI類高分子和支鏈聚乙烯乙二醇6，但分離效果有限且測試結(jié)果仍遠(yuǎn)高于實(shí)際結(jié)果。有人利用水性GPC采用商

10、品PEI為標(biāo)樣、在Ultrahydrogel色譜柱上7分析了PEI-25K供試品和自制的聚乙烯亞胺衍生物，所得結(jié)果雖比文獻(xiàn)結(jié)果更接近理論值，但是測試結(jié)果和廠家提供結(jié)果偏差仍相當(dāng)大。綜上所述，上述各種方法雖然一定程度上實(shí)現(xiàn)了PEI高分子的分析，但是沒有對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性及其重復(fù)性等方面的評(píng)價(jià)，且一些方法使用較特殊的手段和設(shè)備，導(dǎo)致難以在一般的分析實(shí)驗(yàn)室普及應(yīng)用。本文采用PL aquagel-OH 30, PL aquagel-OH 30和PL aquagel-OH 40三柱串聯(lián)色譜柱組、利用通用的聚乙二醇標(biāo)樣實(shí)現(xiàn)了對(duì)PEI的分析分離，考察了影響所得結(jié)果的關(guān)鍵因素且發(fā)現(xiàn)了影響重復(fù)性的主要因素，所得結(jié)果有

11、較好的參考利用價(jià)值。2 實(shí)驗(yàn)部分2.1 藥品及試劑聚乙烯亞胺（PEI）為日本觸媒產(chǎn)高分子化合物，分子量Mn分別為300、600、1200、1800、10000和 70000標(biāo)樣為Varian公司聚乙二醇(PEG)產(chǎn)品，分子量分別為：106、194、440、628、960、1460、4290、7130、12900、20600、50450、71700、174100、255300純水由Millipore超純水離子交換器制得冰乙酸為天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)色譜純?cè)噭o水乙酸鈉為北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司產(chǎn)分析純?cè)噭?.2 儀器設(shè)備美國Waters公司 515 HPLC 泵，RI檢測器：Waters

12、2414，自動(dòng)進(jìn)樣器：Waters 717 plus，Waters 柱溫箱，Empower 1 色譜工作站，色譜柱尺寸：300×7.5mm，填料粒徑：8µm。 2.3 色譜條件色譜柱：PL aquagel-OH 30, PL aquagel-OH 30和PL aquagel-OH 40三柱串聯(lián)流動(dòng)相：0.20.3 mol/L NaAc-HAc緩沖溶液（pH 4.56.0）流速：1.0ml/min，進(jìn)樣體積：200µL，柱溫：30RI檢測器內(nèi)部溫度：30 靈敏度：42.4 樣品測試取系列聚乙二醇標(biāo)樣，分別用流動(dòng)相溶解，取200µL進(jìn)樣。記錄與之對(duì)應(yīng)的保留時(shí)

13、間，用窄分布法作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取系列PEI樣品，分別用流動(dòng)相溶解，然后用0.8µm聚醚砜針頭濾器過濾。取200µL進(jìn)樣，在Empower 1色譜工作站記錄色譜圖，計(jì)算分子量。3結(jié)果與討論如前所述，影響PEI類高分子在凝膠色譜上的分析分離效果的因素很多，所以有必要對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的考察，找到關(guān)鍵因素。我們從最主要的影響因素流動(dòng)相的選擇開始，并進(jìn)一步研究了pH值、離子強(qiáng)度和進(jìn)樣量等的影響，發(fā)現(xiàn)了一些影響分離分析重復(fù)性的關(guān)鍵規(guī)律。3.1流動(dòng)相種類的影響水溶性凝膠滲透色譜在測定高分子化合物時(shí)存在明顯的非體積排除效應(yīng)8，即離子交換、離子排斥、離子包含、疏水作用等作用，該效應(yīng)直接影響樣品分子量

14、的準(zhǔn)確測試，如何消除吸附或降低至最小程度是水溶性GPC測試的關(guān)鍵。根據(jù)不同的色譜柱類型可以選擇NaNO3溶液或緩沖溶液作為流動(dòng)相，消除非體積排除效應(yīng)可以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值和離子強(qiáng)度。流動(dòng)相選擇的主要原則是該流動(dòng)相對(duì)樣品有良好的溶解性，且不與填料發(fā)生作用，還要對(duì)樣品有一定的分離效果。經(jīng)實(shí)驗(yàn)考察，純水，氨水，磷酸鹽溶液作為流動(dòng)相時(shí)都得不到樣品流出峰或者信號(hào)響應(yīng)很低，達(dá)不到我們的測試要求。經(jīng)過篩選發(fā)現(xiàn)pH4.0乙酸-乙酸鈉緩沖溶液對(duì)PEI樣品的響應(yīng)值較大且對(duì)不同分子量的樣品有一定分離效果，如圖1所示：圖1 PEI在pH4.0乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中的色譜圖Figure 1 Chromatogram o

15、f PEI in HAc-NaAc buffer solution with PH 4.0PEI1800PEI10000PEI70000由圖1可以看出：三個(gè)樣品的保留時(shí)間非常接近，峰形不是很對(duì)稱，有拖尾現(xiàn)象。在該條件下利用聚乙二醇標(biāo)樣校正的分子量與樣品的實(shí)際分子量相差很大，見表1所示：表1 PEI樣品實(shí)際分子量和檢測分子量的對(duì)比Table 1 Comparison of the actual value with measured value of PEI molecular weightSamples Actual Mn Measured Mw ErrorPEI1800 1800 1824

16、1.33%PEI10000 10000 2310 76.90%PEI70000 70000 2649 96.22%在上述條件下，PEI樣品與色譜柱填料之間的非體積排除效應(yīng)，導(dǎo)致不同分子量的樣品會(huì)在同一保留時(shí)間出峰，分離不好；所以考慮適當(dāng)調(diào)整流動(dòng)相的pH值，以找到更合適的檢測條件。3.2流動(dòng)相pH值的影響我們分別配制了五種不同pH值的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液作流動(dòng)相，對(duì)四個(gè)PEI樣品進(jìn)行了檢測、比較。為了便于比較分離效果，采用峰值保留時(shí)間Mp來進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pH4.56.0的緩沖溶液對(duì)PEI樣品的分離較好，見表2所示：表2 PEI樣品在不同pH值的流動(dòng)相中檢測到的Mp（min.）Table 2

17、 Mp (min.) of PEI samples measured in mobile phases with different pH valueSamples pH4 pH4.5 pH4.85 pH6.0 pH8PEI1200 - 26.537 26.895 - 28.855PEI1800 26.489 26.159 26.566 26.458 28.773PEI10000 25.676 23.921 24.714 24.082 29.051PEI70000 25.428 15.717 17.424 15.75 29.033通過對(duì)表2所示的五種不同流動(dòng)相中檢測到的色譜峰的峰形以及分離情況

18、的比較，認(rèn)為pH4.5和pH6.0 的條件分離程度較大，比較適合PEI的檢測。3.3流動(dòng)相離子強(qiáng)度的影響為了優(yōu)化和檢驗(yàn)pH4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液作為該方法的流動(dòng)相對(duì)PEI樣品的響應(yīng)值和分離效果，我們考察了不同濃度的流動(dòng)相對(duì)PEI樣品分離的影響。表3 PEI樣品在不同濃度流動(dòng)相中檢測到的Mp（min.）Table 3 Mp (min.) of PEI samples detected in mobile phase with different concentration由表3的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增大流動(dòng)相離子強(qiáng)度有利于減少PEI的吸附，提高樣品的分離效果。在0.1 mol/L條件下，樣品的分離效

19、率很低。難以實(shí)現(xiàn)從分子量300到分子量10000范圍內(nèi)的PEI的有效分離。隨著離子強(qiáng)度的增加，不但各種樣品的出峰時(shí)間提前，而且不同分子量之間的PEI的分離程度加大，實(shí)現(xiàn)了更有效的分離。在現(xiàn)有條件下，盡管離子強(qiáng)度大時(shí)出峰時(shí)間縮短，離子強(qiáng)度由0.2mol/L提高到0.3 mol/L和0.5 mol/L時(shí)的分離程度沒有很大的提高。為了降低柱壓保護(hù)色譜柱，保持流動(dòng)相對(duì)樣品的較高溶解度，我們采用比較經(jīng)濟(jì)的流動(dòng)相濃度0.2mol/L。3.4 進(jìn)樣量的影響我們將PEI1800用pH4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液配成濃度為0.5%的樣品，進(jìn)樣量分別為200µL, 100µL, 50µ

20、;L, 30µL進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖2： 圖2 不同進(jìn)樣量對(duì)樣品分離的影響Figure 2 Chromatogram of PEI with different injection volume volume由圖2可以看出：在該方法中，在不同的進(jìn)樣量下，樣品的出峰時(shí)間基本不變，說明進(jìn)樣量對(duì)PEI樣品的分離效果的影響有限。綜上所述：pH4.5的緩沖溶液是檢測PEI類樣品分子量的最佳條件。我們采用與PEI結(jié)構(gòu)接近的PEG標(biāo)準(zhǔn)樣品做校正曲線。用pH4.5的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液流動(dòng)相配制14個(gè)PEG標(biāo)樣，充分溶解后進(jìn)行檢測，見圖3：圖3 PEG標(biāo)準(zhǔn)樣品在pH4.5的緩沖溶液中的色譜圖Figur

21、e 3 Chromatogram of PEG standard samples in HAc-NaAc buffer solution with pH 4.5由圖3可以看出：PEG各標(biāo)樣的色譜峰對(duì)稱，分離較好，出峰時(shí)間也與樣品的保留時(shí)間接近，可以用于校正樣品的分子量。根據(jù)圖3繪出校正曲線如圖4所示，曲線擬合公式為logMw=3.20e-3.04T+1.16e-1T2-1.60e-3T3 （T為保留時(shí)間）曲線相關(guān)系數(shù)r2=0.9997。圖4 GPC校正曲線Figure 4 Calibration curve of GPC3.5 水溶性GPC檢測PEI樣品的準(zhǔn)確性和重復(fù)性我們考察了PEI1000

22、0在不同檢測條件下的GPC檢測結(jié)果，如表4所示：表 4 不同條件下檢測的PEI10000分子量Table 4 The RSD of the Mn of PEI10000 in different conditionsMeasured Time Injection volume Measured Mn PDI* Error2008.12.24 200µL 11024 1.11 10.24%2009.1.13 200µL 10935 1.10 9.35%2009.2.4 200µL 11005 1.11 10.05%2009.2.4 100µL 11394

23、1.09 13.94%2009.2.5 50µL 11692 1.08 16.92%2009.2.5 20µL 11438 1.06 14.38%*PDI：polydispersity index分子量分布系數(shù)以上六次檢測的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.70%由表4進(jìn)一步證實(shí)：在不同條件下檢測PEI樣品的分子量，結(jié)果非常接近，RSD只有2.70%左右，滿足GPC重復(fù)性在5%左右的要求，說明本方法具有非常優(yōu)秀的重復(fù)性。測量值與實(shí)際值的平均誤差也在12.5%左右，說明本方法同時(shí)具有優(yōu)良的準(zhǔn)確性。4. 結(jié)論（1）通過一系列實(shí)驗(yàn)的考察，我們發(fā)現(xiàn)PEI樣品在乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中的響應(yīng)值較大。（2）對(duì)pH值4.08.0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)pH4.5的緩沖溶液提高了色譜柱對(duì)樣品的分離效率，可以明顯的看出PEI聚合物樣品的分子量差異。（3）增大流動(dòng)相離子強(qiáng)度有利于減少PEI的吸附，提高樣品的分離效果。（4）在該方法中，進(jìn)樣量對(duì)PEI樣品的分離效果的影響有