大腸桿菌培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)辦法

1、大腸桿菌培養(yǎng)基配制及培養(yǎng)辦法集團(tuán)企業(yè)公司編碼：（LL36-大腸桿菌培養(yǎng)一、菌種凍存液的制備含有足量細(xì)菌的液體培養(yǎng)基離心后在沉淀中加入等量40峪甘油，-80凍存。二、培養(yǎng)基制備LB培養(yǎng)基配方（胰化蛋白陳（Trypton） ： 10 g/L；酵母提取物（YeastExtract） ： 5 g/L； NaCl： 10 g/L； pH7. 4）液體培養(yǎng)基胰化蛋白陳10. 0g酵母粉5. 0g氯化鈉10. 0g水 1000mlPH7. 4固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上再加入1. 5%2. 0%的瓊脂三、平板的制備1）稱(chēng)取胰化蛋白陳10.0g,酵母粉5. 0g, NaCllO. 0g,加入800mL二次水

2、溶解，并用玻璃 棒攪拌均勻，用hnol/L的Na0H調(diào)pH至7.4左右，定容至1L,調(diào)pH7.4（若溶液pH 大于7.4,用Imol/LHCl回調(diào)）。2）分裝在錐形瓶中，每瓶量不宜太多，沒(méi)過(guò)瓶底一指左右。如需固體培養(yǎng)基在分裝后的液體培養(yǎng)基內(nèi)加入約2%的瓊脂（150mL液體培養(yǎng)基加入2. 5g瓊脂）。3）在錐形瓶口依次覆蓋帶濾紙通氣小孔的塑料膜和硬質(zhì)紙，用皮筋捆好。所有錐形瓶如 上述操作。用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱(chēng)、配制日期。4）高壓蒸汽滅菌鍋1210c滅菌15mino5）滅菌后的培養(yǎng)基取出置電熱鼓風(fēng)干燥器內(nèi)600c烘干，待錐形瓶的封口紙干燥后取出。 液體培養(yǎng)基可直接保存或使用，此時(shí)加有瓊脂的培養(yǎng)基

3、不會(huì)凝固，可在預(yù)先紫外殺菌 30min以上的無(wú)菌操作臺(tái)上，將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)培養(yǎng)皿培養(yǎng)基約10T5mL （直徑90mm）,在培養(yǎng)皿中厚度大約4mm左右。將平皿疊放在無(wú)菌操作臺(tái)上，放置 lOmin左右，待瓊脂基本凝固可涂平板。6）若平板不直接使用，滅菌后將培養(yǎng)基在錐形瓶中保存，待需制備平板時(shí)，微波爐中火 加熱約3min,使瓊脂熔化，室溫冷卻20min至不燙手可制備平板。四、接種大腸桿菌1）取實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)備的大腸桿菌BL21凍存液，管口用酒精燈灼燒，打開(kāi)離心管。2）接種方法一：用滅菌槍頭蘸取凍存液在平板邊緣上劃?rùn)M條，每三道為一組，旋轉(zhuǎn)平皿 一圈，最后中間劃之字；接種方法二：用移液槍吸取lOOuL溶液于平板上，用酒精燈 滅菌厚的涂抹棒劃十字，涂布平板。3）因?qū)嶒?yàn)一般都要求挑取單菌落，故涂平板適應(yīng)考慮凍存液內(nèi)細(xì)菌數(shù)量，若菌量過(guò)大應(yīng) 適當(dāng)稀釋。一般方法一獲得單菌落的可能性比較大。涂平板應(yīng)在酒精燈附近進(jìn)行，若 凍存液涂完的平板應(yīng)倒置，防止平皿蓋上產(chǎn)生水蒸氣。五、大腸桿菌的培養(yǎng) 1）將接種好的平皿倒置放入37c的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，大約十幾小時(shí)后長(zhǎng)出菌落。2）挑取生長(zhǎng)狀態(tài)好，特征明顯的單個(gè)菌落，接種于新鮮滅菌的LB液體培養(yǎng)基中37C