血紅蛋白的提取及分離

1、血紅蛋白的提取和別離的實驗分析及教學組織人民教育出版社課程教材研究所吳成軍東北師范大學附屬中學趙偉濤“血紅蛋白的提取和別離是人教版選修模塊?生物技術實踐?中的實驗內容,其目的是使學生體驗從復雜細胞混合物體系中提取生物大分子的根本原理、 過程和方法,該實驗雖然操作難度較大,但原理清楚,動會較多,因此,學生的學習興趣很高.下面結合人教版教材對該實驗進行分析并提出相應的教學建議.1.1初步獲取血紅蛋白的原理和方法樣品的處理和粗別離實驗步驟實驗目的實驗原理操作方法結果判斷洗滌紅細胞獲取較純潔的紅細胞通過離心將密度/、同的物質別離低速離心,去除上清液,反復加生理鹽水并離心直到上清液未呈現(xiàn)黃色為止釋放血紅

2、蛋白破裂紅細胞,釋放血紅蛋白低滲溶液中紅細胞破裂；甲苯溶解膜脂,加速細胞破裂相似相溶原理加蒸儲水,再加甲苯,磁力攪拌器充分攪拌無明顯現(xiàn)象別離血紅蛋白溶液初步得到血紅蛋白溶液通過離心將密度/、同的物質別離離心較局速試管溶液分為4層透析去掉液體中的小分子物質小分子物質容易透出透析袋透析12小時透析袋中物質的顏色更紅1.2別離純化蛋白質的原理與方法凝膠色譜法分子篩效應凝膠是一些由多糖類化合物構成的多孔球體,當相對分子質量不同的蛋白質通過凝膠時,相對分子質量較小的蛋白質直徑小于凝膠網(wǎng)孔,由于靜電吸附和擴散作用容易進入凝膠內部的通道,可以自由地進入凝膠顆粒的網(wǎng)孔,在向下移動的過程中,它們從凝膠顆粒的網(wǎng)孔

3、擴散到凝膠顆粒間的孔隙,再進入另一凝膠顆粒的網(wǎng)孔,如此不斷地進出,使流程增長,而最后流出層析柱.而相對分子質量較大的蛋白質無法進入凝膠顆粒的網(wǎng)孔,只能沿著凝膠顆粒間的孔隙,隨著洗脫液流動,流程較短,因此首先流出層析柱.分子量介于二者之間的物質,雖然能夠進入凝膠網(wǎng)孔,但比小分子難,因此進入凝膠網(wǎng)孔的幾率比小分子小,向下移動的速度比小分子快,而比大分子慢.相對分子質量不同的蛋白質分子因此得以別離.需要注意的是,有局部小分子蛋白質未進入凝膠內部,而在外部移動,因此,如果需要得到純度更高的蛋白質分子,可將色譜柱中的凝膠溶液進行平衡后進行再次冼脫和別離.1. 3鑒定蛋白質純度的原理與方法電泳蛋白質分子的

4、根本單位是氨基酸,氨基酸的一些基團在一定的pH下會發(fā)生水解或電離從而帶有電荷.但總的來說蛋白質分子一般帶有負電.在電場的作用下,帶電的蛋白質分子會向著電泳槽中的正極方向移動.由于樣品中各種蛋白質分子凈電荷的量的差異以及蛋白質分子本身的大小等因素,使蛋白質分子產(chǎn)生不同的遷移速率,從而將樣品中各種蛋白質分子別離開O由于蛋白質分子帶電電荷比擬復雜,凈電荷總量與蛋白質分子的質量不成正比,而蛋白質分子的質量又是衡定的,電泳時在帶電量和分子質量兩種因素的作用下會產(chǎn)生遷移速率的復雜化,不能正確地將分子質量不同的蛋白質分子別離開,因此,實際操作中,一般會將蛋白質分子與SDS十二烷基硫酸鈉發(fā)生反響形成蛋白質一S

5、DSM合物,由于SDS所帶負電荷的量大大超過蛋白質分子原有的電荷量,因此掩蓋了不同種蛋白質間的電荷差異,使蛋白質的遷移率完全取決于蛋白質分子質量的大小.在電場條件下,分子量大的蛋白質遷移率慢,離前沿較遠,而分子量小的蛋白質遷移快,離前沿較近.這樣,不同分子量大小的蛋白質得到了別離.如果蛋白質的純度高,遷移率一致,就會形成前沿整潔、清楚的條帶.以上原理和方法中,“初步獲取血紅蛋白的原理和方法比擬簡單,又有必修的根底,因此學生容易理解；凝膠色譜法的原理容易理解,但操作復雜,難度較高,是學生學習的重點； 電泳的原理和方法比擬復雜,絕大多數(shù)學校目前缺乏相應的實驗設備,而且是用于鑒定別離后蛋白質純度的后

6、續(xù)實驗,因此可作為選學內容.基于以上分析,特確定如下的教學目標、教學的重點和難點.2. 1教學目標1.說出從血液中初步獲取血紅蛋白的原理和方法.2.說明凝膠色譜法的原理和方法.3.說出電泳的根本原理和方法.4.進行樣品的預處理.5.運用凝膠色譜法對血紅蛋白進行別離純化.6.2教學重點和難點教學重點：凝膠色譜法的原理和方法.教學難點：樣品的預處理；色譜柱的裝填；純化別離操作.7. 1幾種重要實驗試劑的配制及考前須知3.1.1磷酸緩沖液20mmol/L的配制及考前須知配制步驟配制的溶液配制方法考前須知0.2mol/L的NaHP烯液將71.64g的NadHPOT12H20充分溶解于1000mL的蒸儲

7、水中在混合兩種溶液時,注意用酸度計或pH試紙檢測,并調節(jié)溶液的pH在7.0左右0.2mol/L的NaHPO溶液將31.21g的NaHPO-2H20充分溶解于1000mL的蒸儲水中充分溶解pH約為7.0的20mmol/L磷酸緩沖液取61m嶼驟中配制的NKHPO溶液與39mL步驟中配制的NaHPO溶液混合3.1.2丙烯酰胺和N,N-甲叉雙丙烯酰胺的配制及考前須知將29g丙烯酰胺和1gN,N-甲叉雙丙烯酰胺溶于總體積為70mL的水中,攪拌過夜使之充分溶解.考前須知：丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強的神經(jīng)毒性并可通過皮膚吸收,因此,操作時需要戴上手套和防毒面具,而且在通風櫥內或通風處進行.價格較低的這兩種

8、藥物中含有一些金屬離子,為除去這些金屬離子,可以在丙烯酰胺溶液中參加大約0.2倍體積的單床混合樹脂,攪拌放置一夜后,再用Whatman1號濾紙過濾就可以純化.儲存期間,由于光或堿的催化作用,丙烯酰胺和雙丙烯酰胺會緩慢轉化成丙烯酸和雙丙烯酸,因此,應將配制好的溶液置于棕色瓶中,置于4C保存,并且使用前應檢查該溶液的pH,以保證pH不超過7.0.3.1.3SDS的配制及考前須知將SDS用去離子水配制成10%勺貯存液,于室溫保存.考前須知：市售的SDSft學純度不夠,需要重結晶后使用.重結晶方法如下：稱取20gSDS,放入500mL圓底燒瓶中,加半勺活性炭及300mL無水乙醇,攪拌,搖勻.燒瓶上接一

9、個小冷凝管.在水浴上加熱至乙醇微沸,回流約10min,用熱過濾漏斗趁熱過濾.濾液應透明無色.濾液冷卻至室溫后,移至-20C過夜.第二天,通過預冷的布氏漏斗抽濾,用少量-20C無水乙醇洗沉淀3次,盡量抽干,將結晶置真空枯燥器中枯燥或40c烘箱中烘干.3.2凝膠色譜柱的制作和裝填3.2.1凝膠色譜柱的制作取長100cm,內直徑1.6cm的玻璃管,兩端需用砂紙磨平.底塞打孔一挖出凹穴一安裝移液管頭部一覆蓋尼龍網(wǎng),再用100目尼龍紗包好,插到玻璃管的一端.考前須知：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面,否那么難以鋪實尼龍網(wǎng),還會導致液體殘留,導致蛋白質別離不徹底.3.2.2凝膠色譜柱的裝填

10、計算并稱取一定量的交聯(lián)葡聚糖凝膠浸泡于蒸儲水或洗脫液中充分溶脹后,配成凝膠懸浮液.將色譜柱裝置固定在支架上,將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內,凝膠沉集后,將溶劑放出至膠面不再下降,并且通過23倍柱床體積的溶劑20mmol/L的磷酸緩沖液,pH7.0 使柱床穩(wěn)定.裝填時輕輕敲動色譜柱,使凝膠填裝均勻.裝填完畢后,立即用緩沖液洗脫瓶,在50cm高的操作壓下,用300mL的20mmol/L的磷酸緩沖液pH為7.0充分洗滌平衡12h.考前須知：凝膠裝填時盡量緊密,以降低凝膠顆粒之間的空隙；裝填凝膠柱時不得有氣泡存在,由于氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序,降低別離效果；液面不要低于凝膠外表,否那么可

11、能有氣泡混入,影響液體在柱內的流動,從而影響生物大分子物質的別離效果；注意不能發(fā)生洗脫液流干,露出凝膠顆粒的現(xiàn)象.本課題的主要目的是運用凝膠色譜法對蛋白質進行別離純化,以下是實驗操作流程.1:1凝劑肝素1250U/mL或適宜濃度的檸檬酸鈉溶液將6g檸檬酸鈉溶于100mL的生理鹽水中,假設要過夜,溫度須限制在4C左右.在樣品處理的流程中,第一步用到低速離心,而第三步用到高速離心,這主要是由于血液中除有紅細胞外,還有其他細胞及大量的物質,紅細胞與這些物質之間的密度存在較大的差異,用低速離心就能將他們別離開；而“別離血紅蛋白溶液步驟中,溶液的主要成份的密度相對要接近些,因此需要用較高速的離心,才能將

12、這些物質初步別離.攪拌好的混合液離心后明顯分為4層如右圖,由上至下依次是甲苯層、脂溶性物質的沉淀層、血紅蛋白的水溶液、紅細胞破碎物沉淀.取其上清液,用濾紙過濾除去脂類,再使濾液在分液漏斗中靜置5min,出現(xiàn)分層,別離出下層的血紅蛋白溶液.粗別離：將血紅蛋白溶液裝入規(guī)格為7000D的透析袋,按1:300的比例放入20mmol/L的磷酸鹽緩沖液pH為7.0,透析12h.透析的目的一是為了除去小分子蛋白質,二是使血紅,白處于緩沖液環(huán)境中,便于后續(xù)的磷酸緩沖液在凝膠柱中進行洗脫.純化：可采用柱型為SephadexG75,柱體積為500mL的色譜柱；加樣量為10mL約含蛋白200mg；用20mmol/L

13、的磷酸鹽緩沖液pH為7.0進行洗脫,洗脫速度可限制為0.5mL/min,即20min/管.此時可用A280的紫外線進行檢測,如果測得的數(shù)值很高,說明蛋白含量過高,此時需要進行稀釋.以下圖是將每管取0.5mL稀釋10倍后,用紫外線測量的結果如以下圖.由圖中數(shù)值可知,33-38管對應的數(shù)值為血紅蛋白的吸收值,選擇此時的試管進行蛋白質,屯度的鑒定是比擬適宜的.純度鑒定：經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定,以下是實驗操作流程.來說,條帶清楚,目的條帶清楚,無擴散,前沿比擬直,說明實驗結果比擬好,樣品比擬純,下面為兔血實驗的電泳結果圖.果口脫觀察色色納果本課題可安排45課時.教師可在實驗前配制好磷酸緩沖液

14、,并購置或制作好凝膠色譜柱,以備實驗時使用.課時安排授課或實驗內容補充說明第12課時講授凝膠色譜法和電泳的根本原理透析和平衡凝膠需要的時間較長,可由教師完成；電泳可由教師演不完成第3課時進行樣品的處理洗滌、釋放、別離和透析第4課時運用凝膠色譜法對血紅蛋白進行純化增加1課時通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對提取的蛋白質進行純度鑒定由于大多數(shù)學校缺乏相應的實驗設備,操作難度較高,因此,本實驗可由教師以講清實驗原理和演示操作為主,并配以相應的實驗錄像進行教學.本課題的實驗操作相對復雜,影響實驗效果的關鍵環(huán)節(jié)之一是凝膠色譜柱的制作和裝填,對實驗者的操作有很高的要求,建議有條件的學校直接購置商品色譜柱.由于甲苯是劇毒試劑,不太適合在中學實驗中使用,因此,我們嘗試在血紅蛋白