血紅蛋白的提取及分離

1、血紅蛋白的提取和別離的實(shí)驗(yàn)分析及教學(xué)組織人民教育出版社課程教材研究所吳成軍東北師范大學(xué)附屬中學(xué)趙偉濤“血紅蛋白的提取和別離是人教版選修模塊?生物技術(shù)實(shí)踐?中的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,其目的是使學(xué)生體驗(yàn)從復(fù)雜細(xì)胞混合物體系中提取生物大分子的根本原理、 過程和方法,該實(shí)驗(yàn)雖然操作難度較大,但原理清楚,動(dòng)會(huì)較多,因此,學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣很高.下面結(jié)合人教版教材對(duì)該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析并提出相應(yīng)的教學(xué)建議.1.1初步獲取血紅蛋白的原理和方法樣品的處理和粗別離實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理操作方法結(jié)果判斷洗滌紅細(xì)胞獲取較純潔的紅細(xì)胞通過離心將密度/、同的物質(zhì)別離低速離心,去除上清液,反復(fù)加生理鹽水并離心直到上清液未呈現(xiàn)黃色為止釋放血紅

2、蛋白破裂紅細(xì)胞,釋放血紅蛋白低滲溶液中紅細(xì)胞破裂；甲苯溶解膜脂,加速細(xì)胞破裂相似相溶原理加蒸儲(chǔ)水,再加甲苯,磁力攪拌器充分?jǐn)嚢锜o明顯現(xiàn)象別離血紅蛋白溶液初步得到血紅蛋白溶液通過離心將密度/、同的物質(zhì)別離離心較局速試管溶液分為4層透析去掉液體中的小分子物質(zhì)小分子物質(zhì)容易透出透析袋透析12小時(shí)透析袋中物質(zhì)的顏色更紅1.2別離純化蛋白質(zhì)的原理與方法凝膠色譜法分子篩效應(yīng)凝膠是一些由多糖類化合物構(gòu)成的多孔球體,當(dāng)相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時(shí),相對(duì)分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)直徑小于凝膠網(wǎng)孔,由于靜電吸附和擴(kuò)散作用容易進(jìn)入凝膠內(nèi)部的通道,可以自由地進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔,在向下移動(dòng)的過程中,它們從凝膠顆粒的網(wǎng)孔

3、擴(kuò)散到凝膠顆粒間的孔隙,再進(jìn)入另一凝膠顆粒的網(wǎng)孔,如此不斷地進(jìn)出,使流程增長,而最后流出層析柱.而相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)無法進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔,只能沿著凝膠顆粒間的孔隙,隨著洗脫液流動(dòng),流程較短,因此首先流出層析柱.分子量介于二者之間的物質(zhì),雖然能夠進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔,但比小分子難,因此進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔的幾率比小分子小,向下移動(dòng)的速度比小分子快,而比大分子慢.相對(duì)分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子因此得以別離.需要注意的是,有局部小分子蛋白質(zhì)未進(jìn)入凝膠內(nèi)部,而在外部移動(dòng),因此,如果需要得到純度更高的蛋白質(zhì)分子,可將色譜柱中的凝膠溶液進(jìn)行平衡后進(jìn)行再次冼脫和別離.1. 3鑒定蛋白質(zhì)純度的原理與方法電泳蛋白質(zhì)分子的

4、根本單位是氨基酸,氨基酸的一些基團(tuán)在一定的pH下會(huì)發(fā)生水解或電離從而帶有電荷.但總的來說蛋白質(zhì)分子一般帶有負(fù)電.在電場的作用下,帶電的蛋白質(zhì)分子會(huì)向著電泳槽中的正極方向移動(dòng).由于樣品中各種蛋白質(zhì)分子凈電荷的量的差異以及蛋白質(zhì)分子本身的大小等因素,使蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生不同的遷移速率,從而將樣品中各種蛋白質(zhì)分子別離開O由于蛋白質(zhì)分子帶電電荷比擬復(fù)雜,凈電荷總量與蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量不成正比,而蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量又是衡定的,電泳時(shí)在帶電量和分子質(zhì)量兩種因素的作用下會(huì)產(chǎn)生遷移速率的復(fù)雜化,不能正確地將分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)分子別離開,因此,實(shí)際操作中,一般會(huì)將蛋白質(zhì)分子與SDS十二烷基硫酸鈉發(fā)生反響形成蛋白質(zhì)一S

5、DSM合物,由于SDS所帶負(fù)電荷的量大大超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量,因此掩蓋了不同種蛋白質(zhì)間的電荷差異,使蛋白質(zhì)的遷移率完全取決于蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的大小.在電場條件下,分子量大的蛋白質(zhì)遷移率慢,離前沿較遠(yuǎn),而分子量小的蛋白質(zhì)遷移快,離前沿較近.這樣,不同分子量大小的蛋白質(zhì)得到了別離.如果蛋白質(zhì)的純度高,遷移率一致,就會(huì)形成前沿整潔、清楚的條帶.以上原理和方法中,“初步獲取血紅蛋白的原理和方法比擬簡單,又有必修的根底,因此學(xué)生容易理解；凝膠色譜法的原理容易理解,但操作復(fù)雜,難度較高,是學(xué)生學(xué)習(xí)的重點(diǎn)； 電泳的原理和方法比擬復(fù)雜,絕大多數(shù)學(xué)校目前缺乏相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備,而且是用于鑒定別離后蛋白質(zhì)純度的后

6、續(xù)實(shí)驗(yàn),因此可作為選學(xué)內(nèi)容.基于以上分析,特確定如下的教學(xué)目標(biāo)、教學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn).2. 1教學(xué)目標(biāo)1.說出從血液中初步獲取血紅蛋白的原理和方法.2.說明凝膠色譜法的原理和方法.3.說出電泳的根本原理和方法.4.進(jìn)行樣品的預(yù)處理.5.運(yùn)用凝膠色譜法對(duì)血紅蛋白進(jìn)行別離純化.6.2教學(xué)重點(diǎn)和難點(diǎn)教學(xué)重點(diǎn)：凝膠色譜法的原理和方法.教學(xué)難點(diǎn)：樣品的預(yù)處理；色譜柱的裝填；純化別離操作.7. 1幾種重要實(shí)驗(yàn)試劑的配制及考前須知3.1.1磷酸緩沖液20mmol/L的配制及考前須知配制步驟配制的溶液配制方法考前須知0.2mol/L的NaHP烯液將71.64g的NadHPOT12H20充分溶解于1000mL的蒸儲(chǔ)

7、水中在混合兩種溶液時(shí),注意用酸度計(jì)或pH試紙檢測(cè),并調(diào)節(jié)溶液的pH在7.0左右0.2mol/L的NaHPO溶液將31.21g的NaHPO-2H20充分溶解于1000mL的蒸儲(chǔ)水中充分溶解pH約為7.0的20mmol/L磷酸緩沖液取61m嶼驟中配制的NKHPO溶液與39mL步驟中配制的NaHPO溶液混合3.1.2丙烯酰胺和N,N-甲叉雙丙烯酰胺的配制及考前須知將29g丙烯酰胺和1gN,N-甲叉雙丙烯酰胺溶于總體積為70mL的水中,攪拌過夜使之充分溶解.考前須知：丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并可通過皮膚吸收,因此,操作時(shí)需要戴上手套和防毒面具,而且在通風(fēng)櫥內(nèi)或通風(fēng)處進(jìn)行.價(jià)格較低的這兩種

8、藥物中含有一些金屬離子,為除去這些金屬離子,可以在丙烯酰胺溶液中參加大約0.2倍體積的單床混合樹脂,攪拌放置一夜后,再用Whatman1號(hào)濾紙過濾就可以純化.儲(chǔ)存期間,由于光或堿的催化作用,丙烯酰胺和雙丙烯酰胺會(huì)緩慢轉(zhuǎn)化成丙烯酸和雙丙烯酸,因此,應(yīng)將配制好的溶液置于棕色瓶中,置于4C保存,并且使用前應(yīng)檢查該溶液的pH,以保證pH不超過7.0.3.1.3SDS的配制及考前須知將SDS用去離子水配制成10%勺貯存液,于室溫保存.考前須知：市售的SDSft學(xué)純度不夠,需要重結(jié)晶后使用.重結(jié)晶方法如下：稱取20gSDS,放入500mL圓底燒瓶中,加半勺活性炭及300mL無水乙醇,攪拌,搖勻.燒瓶上接一

9、個(gè)小冷凝管.在水浴上加熱至乙醇微沸,回流約10min,用熱過濾漏斗趁熱過濾.濾液應(yīng)透明無色.濾液冷卻至室溫后,移至-20C過夜.第二天,通過預(yù)冷的布氏漏斗抽濾,用少量-20C無水乙醇洗沉淀3次,盡量抽干,將結(jié)晶置真空枯燥器中枯燥或40c烘箱中烘干.3.2凝膠色譜柱的制作和裝填3.2.1凝膠色譜柱的制作取長100cm,內(nèi)直徑1.6cm的玻璃管,兩端需用砂紙磨平.底塞打孔一挖出凹穴一安裝移液管頭部一覆蓋尼龍網(wǎng),再用100目尼龍紗包好,插到玻璃管的一端.考前須知：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面,否那么難以鋪實(shí)尼龍網(wǎng),還會(huì)導(dǎo)致液體殘留,導(dǎo)致蛋白質(zhì)別離不徹底.3.2.2凝膠色譜柱的裝填

10、計(jì)算并稱取一定量的交聯(lián)葡聚糖凝膠浸泡于蒸儲(chǔ)水或洗脫液中充分溶脹后,配成凝膠懸浮液.將色譜柱裝置固定在支架上,將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內(nèi),凝膠沉集后,將溶劑放出至膠面不再下降,并且通過23倍柱床體積的溶劑20mmol/L的磷酸緩沖液,pH7.0 使柱床穩(wěn)定.裝填時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱,使凝膠填裝均勻.裝填完畢后,立即用緩沖液洗脫瓶,在50cm高的操作壓下,用300mL的20mmol/L的磷酸緩沖液pH為7.0充分洗滌平衡12h.考前須知：凝膠裝填時(shí)盡量緊密,以降低凝膠顆粒之間的空隙；裝填凝膠柱時(shí)不得有氣泡存在,由于氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序,降低別離效果；液面不要低于凝膠外表,否那么可

11、能有氣泡混入,影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng),從而影響生物大分子物質(zhì)的別離效果；注意不能發(fā)生洗脫液流干,露出凝膠顆粒的現(xiàn)象.本課題的主要目的是運(yùn)用凝膠色譜法對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行別離純化,以下是實(shí)驗(yàn)操作流程.1:1凝劑肝素1250U/mL或適宜濃度的檸檬酸鈉溶液將6g檸檬酸鈉溶于100mL的生理鹽水中,假設(shè)要過夜,溫度須限制在4C左右.在樣品處理的流程中,第一步用到低速離心,而第三步用到高速離心,這主要是由于血液中除有紅細(xì)胞外,還有其他細(xì)胞及大量的物質(zhì),紅細(xì)胞與這些物質(zhì)之間的密度存在較大的差異,用低速離心就能將他們別離開；而“別離血紅蛋白溶液步驟中,溶液的主要成份的密度相對(duì)要接近些,因此需要用較高速的離心,才能將

12、這些物質(zhì)初步別離.攪拌好的混合液離心后明顯分為4層如右圖,由上至下依次是甲苯層、脂溶性物質(zhì)的沉淀層、血紅蛋白的水溶液、紅細(xì)胞破碎物沉淀.取其上清液,用濾紙過濾除去脂類,再使濾液在分液漏斗中靜置5min,出現(xiàn)分層,別離出下層的血紅蛋白溶液.粗別離：將血紅蛋白溶液裝入規(guī)格為7000D的透析袋,按1:300的比例放入20mmol/L的磷酸鹽緩沖液pH為7.0,透析12h.透析的目的一是為了除去小分子蛋白質(zhì),二是使血紅,白處于緩沖液環(huán)境中,便于后續(xù)的磷酸緩沖液在凝膠柱中進(jìn)行洗脫.純化：可采用柱型為SephadexG75,柱體積為500mL的色譜柱；加樣量為10mL約含蛋白200mg；用20mmol/L

13、的磷酸鹽緩沖液pH為7.0進(jìn)行洗脫,洗脫速度可限制為0.5mL/min,即20min/管.此時(shí)可用A280的紫外線進(jìn)行檢測(cè),如果測(cè)得的數(shù)值很高,說明蛋白含量過高,此時(shí)需要進(jìn)行稀釋.以下圖是將每管取0.5mL稀釋10倍后,用紫外線測(cè)量的結(jié)果如以下圖.由圖中數(shù)值可知,33-38管對(duì)應(yīng)的數(shù)值為血紅蛋白的吸收值,選擇此時(shí)的試管進(jìn)行蛋白質(zhì),屯度的鑒定是比擬適宜的.純度鑒定：經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定,以下是實(shí)驗(yàn)操作流程.來說,條帶清楚,目的條帶清楚,無擴(kuò)散,前沿比擬直,說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果比擬好,樣品比擬純,下面為兔血實(shí)驗(yàn)的電泳結(jié)果圖.果口脫觀察色色納果本課題可安排45課時(shí).教師可在實(shí)驗(yàn)前配制好磷酸緩沖液

14、,并購置或制作好凝膠色譜柱,以備實(shí)驗(yàn)時(shí)使用.課時(shí)安排授課或?qū)嶒?yàn)內(nèi)容補(bǔ)充說明第12課時(shí)講授凝膠色譜法和電泳的根本原理透析和平衡凝膠需要的時(shí)間較長,可由教師完成；電泳可由教師演不完成第3課時(shí)進(jìn)行樣品的處理洗滌、釋放、別離和透析第4課時(shí)運(yùn)用凝膠色譜法對(duì)血紅蛋白進(jìn)行純化增加1課時(shí)通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行純度鑒定由于大多數(shù)學(xué)校缺乏相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備,操作難度較高,因此,本實(shí)驗(yàn)可由教師以講清實(shí)驗(yàn)原理和演示操作為主,并配以相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)錄像進(jìn)行教學(xué).本課題的實(shí)驗(yàn)操作相對(duì)復(fù)雜,影響實(shí)驗(yàn)效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一是凝膠色譜柱的制作和裝填,對(duì)實(shí)驗(yàn)者的操作有很高的要求,建議有條件的學(xué)校直接購置商品色譜柱.由于甲苯是劇毒試劑,不太適合在中學(xué)實(shí)驗(yàn)中使用,因此,我們嘗試在血紅蛋白