硬脂酸鎂的微生物限度檢查

1、硬脂酸鎂的微生物限度檢查一、 概述本報告按USP31中“61-62非滅菌產(chǎn)品的微生物學檢查”的規(guī)定，對硬脂酸美的微生物學檢查方法學考察。參照企業(yè)提供標準，通過測試實驗制定適合于本品的微生物學檢查的方法。企業(yè)提供標準：總需氣菌數(shù)（TAMC）不得過1000 cfu/g；霉菌及酵母菌總數(shù)（TYMC）不得過500 cfu/g；每1g樣品不得檢出大腸埃希菌；每10g樣品不得檢出沙門氏菌。二、 方法學1、 培養(yǎng)基及試劑實驗用培養(yǎng)基及緩沖液均符合USP規(guī)定。BP：pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液CA：溴化十六烷基三甲銨MCA：麥康凱瓊脂MCB：麥康凱肉湯MSA：甘露醇鹽瓊脂RVS：RV沙門菌增菌肉湯SDA：沙氏

2、葡萄糖瓊脂SDB：沙氏葡萄糖肉湯TSA：大豆胰酪胨瓊脂TSB：大豆胰酪胨肉湯XLD：賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂2、 實驗菌株黑曲霉 ATCC16404枯草芽孢桿菌 ATCC6633，CMCC(B)63501白色念珠菌 ATCC10231，CMCC(F)98001大腸埃希菌 ATCC8739銅綠假單胞菌 ATCC9027霍亂沙門氏菌 ATCC14028金黃色葡萄球菌 ATCC6538，CMCC(B)26003本實驗取用中國臨床醫(yī)學菌種保存中心（CMCC）的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和金黃色葡萄球菌。這三株菌也來源于ATCC。實驗用菌株，自種子批啟用傳代不超過5次。黑曲霉為3個月內(nèi)制得的4保存的孢子懸液，

3、可直接稀釋使用。參照表格2，將其他6株菌分別接種至規(guī)定的培養(yǎng)條件培養(yǎng)。上述各菌分別以pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液10倍稀釋至大約50-100 cfu/mL的濃度，備用。參照表格2各菌株的生長條件，采用澆碟法測定稀釋得到的最終菌液濃度。3、 方法學本部分主要包括培養(yǎng)基特性測試和方法的適用性考察。3.1 培養(yǎng)基特性測試按照USP31中“61-62非滅菌產(chǎn)品的微生物學檢查”的規(guī)定，與已經(jīng)通過測試驗證的參比培養(yǎng)基（M）相比，當微生物限度檢查用培養(yǎng)基（M）符合以下標準，則用于硬脂酸美的微生物學檢驗：a. 固體培養(yǎng)基的促生長能力：與M相比，M的回收率應在50%-200%之間。b. 固體培養(yǎng)基指示能力：與M

4、相比，規(guī)定菌株在M的生長特征應與之類似。c. 液體培養(yǎng)基促生長能力：與M相比，規(guī)定菌株在M有明顯渾濁。d. 抑制能力：無論是固體培養(yǎng)基或是液體培養(yǎng)基，規(guī)定菌株在其不得生長。對于固體培養(yǎng)基，通常采用平皿計數(shù)法(包括澆碟法和表面接種法)來評價培養(yǎng)基特性，每次平行測試兩皿，最后取平均數(shù)為計算結果。培養(yǎng)基特性測試結果見表格3-表格5。3.2 方法適用性當微生物學檢查方法符合以下要求時，說明該方法適用該品種：a. 樣品供試液不得抑制測試菌株的生長。計數(shù)實驗中，測試微生物在供試樣品中的回收率不得低于接種量的50%；控制菌檢查中，測試菌在含有規(guī)定量供試品的環(huán)境中應可以生長。b. 樣品自身含有的微生物水平不得

5、干擾菌株回收實驗。供試液制備：以70%的乙醇擦拭供試品的外包裝，使自然揮干。由于硬脂酸美是一種脂溶性物質(zhì)，因此用表面活性劑吐溫-80將其溶解。無菌操作取10g硬脂酸美置滅菌過的三角燒瓶，加入一定量的45滅菌的含1%吐溫-80的pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，振搖使分散均勻，制成1:40的供試液。計數(shù)方法適用性：a. 實驗組：取4個直徑為9cm的無菌平皿。其中兩個平皿中加入1:40供試液4mL和50-100cfu 測試菌，取另兩平皿加入1:40供試液2mL和50-100cfu測試菌。每個平皿傾注45表格2中的規(guī)定培養(yǎng)基，搖勻。待瓊脂凝固后，參照表格2的條件倒置培養(yǎng)。5株測試菌（黑曲霉、枯草芽孢桿菌

6、、白色念珠菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌）均進行該測試。b. 樣品組：取8個直徑為9cm的無菌平皿。其中兩個平皿中分別加入1:40供試液4mL和2mL，每個平皿傾注45 TSA；取另兩平皿加入1:40供試液4mL和2mL，每個平皿傾注45 SDA；各平行測試兩皿。參照表格2培養(yǎng)。記錄平皿計數(shù)結果，計算測試菌回收率。c. 菌液組：計數(shù)方法適用性檢查中測試菌包括5株測試菌，分別為黑曲霉、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌。參考表格2培養(yǎng)條件，采用澆碟法計數(shù)，確定接種量。d. 回收率計算公式如下：A-實驗組平均菌落數(shù)；B-樣品組平均菌落數(shù)；C-菌液組平均菌落數(shù)?？刂凭鷾y試方法適

7、用性：大腸埃希菌a. 預培養(yǎng)：取1:40供試液40mL（相當于1g）至400mL滅菌TSB，混勻，置30至35培養(yǎng)18至24小時。b. 陽性組1：接種50-100cfu大腸埃希菌至滅菌TSB中，置30至35培養(yǎng)18至24小時。c. 實驗組1：取1:40供試液40mL（相當于1g）和50-100cfu大腸埃希菌至400mL滅菌TSB，混勻，置30至35培養(yǎng)18至24小時。d. 陽性組2：取1mL滅菌TSB和50-100cfu大腸埃希菌至100mL滅菌麥康凱肉湯中，置42至44培養(yǎng)24至48小時；劃線接種至麥康凱瓊脂，30至35培養(yǎng)18至72小時。e. 實驗組2：取TSB預培養(yǎng)物1mL和50-10

8、0cfu大腸埃希菌至100mL滅菌麥康凱肉湯中，置42至44培養(yǎng)24至48小時。劃線接種至麥康凱瓊脂，30至35培養(yǎng)18至72小時。沙門氏菌a. 預培養(yǎng)：無菌操作取10g硬脂酸美置滅菌過的三角燒瓶，加入45的400mL1%吐溫-80的滅菌TSB，振搖使分散均勻，置30至35培養(yǎng)18至24小時。b. 陽性組1：接種50-100cfu霍亂沙門氏菌至滅菌的1%吐溫-80的TSB中，置30至35培養(yǎng)18至24小時。c. 實驗組1：無菌操作取10g硬脂酸美置滅菌過的三角燒瓶，加入45的400mL滅菌的1%吐溫-80的TSB，振搖使分散均勻。加入50-100cfu霍亂沙門氏菌置30至35培養(yǎng)18至24小時

9、。d. 陽性組2：取0.1mL滅菌TSB（含1%吐溫-80）和50-100cfu霍亂沙門氏菌至10mL滅菌RVS肉湯中，30至35培養(yǎng)18至24小時；劃線接種至XLD瓊脂，30至35培養(yǎng)18至48小時。e. 實驗組2：取TSB（含1%吐溫-80）預培養(yǎng)物0.1mL和50-100cfu霍亂沙門氏菌至10mL滅菌RVS肉湯中，30至35培養(yǎng)18至24小時；劃線接種至XLD瓊脂，30至35培養(yǎng)18至48小時。4、 討論表格3至表格5表明本品涉及到所有培養(yǎng)基均符合微生物學檢查用的要求。培養(yǎng)基的滅菌方式各異，參見表格1。表格6至表格8表明硬脂酸美并不抑制各株測試菌的生長。計數(shù)實驗中，膠囊殼自身的顏色使得

10、瓊脂清晰度降低，使得對3株細菌（枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌）的計數(shù)較為困難，但并不影響黑曲霉和酵母菌的計數(shù)。因此，通過方法適用性實驗，確定以增加培養(yǎng)基體積的方式使得平皿計數(shù)可行?？刂凭鷻z查方法依照常規(guī)方法即可滿足。本品微生物學檢查方法的具體內(nèi)容在后續(xù)細述，詳見“微生物學檢查檢驗操作程序”。三、 微生物學檢查檢驗操作程序1、 供試樣品制備以70%的乙醇擦拭供試品的外包裝，使自然揮干。無菌操作取10g硬脂酸美置滅菌過的三角燒瓶，加入的45含1%吐溫-80滅菌pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖液，振搖使分散均勻，制成1:40的供試液。取1:40供試液4mL至6mL pH7.0氯化鈉蛋白胨緩沖

11、液，制得1:100供試液。2、 計數(shù)測試實驗中均使用直徑為9cm的滅菌平皿。a. 需氣菌計數(shù)（TAMC）：取1:40供試液2mL，平行測定4皿；取1:100供試液1mL，平行測定2皿，分別傾注15-20mL45 TSA瓊脂，充分搖勻分散供試品。待平皿中瓊脂凝固后，30-35倒置培養(yǎng)3至5天。b. 霉菌和酵母菌計數(shù)（TYMC）：取1:40供試液2mL，平行測定4皿，；取1:100供試液1mL，平行測定2皿，傾注15-20mL45 SDA瓊脂，充分搖勻分散供試品。待平皿中瓊脂凝固后，20-25倒置培養(yǎng)5至7天。按照規(guī)定培養(yǎng)條件結束培養(yǎng)后，點擊平皿中的菌落數(shù)（CFU）。通過平皿計數(shù)結果求算均值，最后

12、轉換為相當于每g樣品中含有的菌落數(shù)。若樣品中未檢出菌落，則結果可解釋為“每g樣品中菌落數(shù)少于10個。”。3、 控制菌檢查3.1 大腸埃希菌取1:40供試液40mL（相當于1g）至400mL TSB，混勻，置30至35培養(yǎng)18至24小時，觀察結果。取TSB培養(yǎng)物2mL接種至100mL麥康凱肉湯，置42至44培養(yǎng)24至48小時，觀察結果并劃線接種至麥康凱瓊脂，置30至35培養(yǎng)18至72小時，逐日觀察結果。3.2 沙門氏菌無菌操作取10g硬脂酸美置滅菌過的三角燒瓶，加入400mL的45滅菌TSB（含1%吐溫-80），振搖使分散均勻，置30至35培養(yǎng)18至24小時，觀察結果。取0.1mL TSB培養(yǎng)物

13、接種至10mLRVS肉湯，置30至35培養(yǎng)18至24小時，觀察結果并劃線接種至XLD瓊脂，置30至35培養(yǎng)18至48小時，逐日觀察結果。4、 陰性對照實驗設置陰性對照組，以確證實驗操作條件的可靠性。陰性對照操作同上述操作過程，其中以稀釋劑代替供試品同步操作。表格:表格 1 : 培養(yǎng)基來源信息參比培養(yǎng)基測試用培養(yǎng)基滅菌條件廠家批號廠家批號BP/美壇090205121, 15minMCANICPBPDCM0008美壇070124121, 15minMCBNICPBPDCM0013美壇080321121, 15minRVSNICPBPDCM0003MerckVM855366721115, 15min

14、SDANICPBPDCM0005美壇070315121, 15minSDBNICPBPDCM0001美壇090209121, 15minTSANICPBPDCM0002美壇080701121, 15minTSBNICPBPDCM0011美壇090414121, 15minXLDNICPBPDCM0012BD7088156Heat to boiling表格 2 : 測試用菌株生長條件測試用菌株菌株復蘇用培養(yǎng)基計數(shù)用培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時間黑曲霉/SDA20-255-7days枯草芽孢桿菌TSBTSA30-353-5days白色念珠菌SDBSDA20-255-7days大腸埃希菌TSBTSA30-3

15、53-5days銅綠假單胞菌TSBTSA30-353-5days霍亂沙門氏菌TSBTSA30-353-5days金黃色葡萄球菌TSBTSA30-353-5days表格3. 固體培養(yǎng)基促生長能力測試結果培養(yǎng)基測試菌株測試次數(shù)平均菌落數(shù)回收率(%)接種量回收量TSA黑曲霉119178721916863928189枯草芽孢桿菌1135114852858296312812084白色念珠菌152509526451793775773銅綠假單胞菌18956632382564314211581金黃色葡萄球菌181536625839673523975SDA黑曲霉145439422625963241981白色念珠

16、菌188859724842873565294MCA大腸埃希菌1168161962125160128380100125XLD霍亂沙門氏菌1967881211092843125132106方法: 澆碟法 表面接種法接種量-M菌落計數(shù)結果；回收量-M菌落計數(shù)結果表格4. 固體培養(yǎng)基指示能力和抑制能力測試結果培養(yǎng)基測試菌株指示能力抑制能力MCA大腸埃希菌紫紅色或粉紅色圓形菌落。/XLD霍亂沙門氏菌紅色菌落，有黑色中心。/大腸埃希菌白色圓形菌落/表格4中各測試均采用表面接種法。表格5. 液體培養(yǎng)基促生長能力和抑制能力測試培養(yǎng)基測試菌株促生長能力抑制能力TSB枯草芽孢桿菌+/銅綠假單胞菌+/金黃色葡萄球菌+/SDB白色念珠菌+/MCB大腸埃希菌+/金黃色葡萄球菌/No growthRVS霍亂沙門氏菌+/金黃色葡萄球菌/No growth表格 6. 計數(shù)方法適用性考察結果測試菌株測試次數(shù)平均菌落數(shù)回收率(%)接種量回收量枯草芽孢桿菌13331942109978931059691銅綠假單胞菌11701549