安賀拉滴眼液治療兔干眼癥的免疫病理學(xué)研究

1、安賀拉滴眼液治療兔干眼癥的免疫病理學(xué)研究【摘要】 目的觀察安賀拉滴眼液應(yīng)用于兔干眼癥治療的免疫病 理學(xué)變化，初步探討安賀拉滴眼液治療干眼癥的可能機(jī)制。方法新西蘭白兔20只，制作堿燒傷干眼模型，隨機(jī)分為對照組和安賀拉組，分別滴生理鹽水和安賀拉 滴眼液。用藥4周后應(yīng)用印跡細(xì)胞學(xué)和免疫病理學(xué)方法檢測結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度、 MUC5A陽性細(xì)胞率和炎性細(xì)胞浸潤密度。結(jié)果對照組結(jié)膜炎性細(xì)胞浸潤密度高 于安賀拉組,安賀拉組杯狀細(xì)胞密度和 MUC5A陽性細(xì)胞率均大于對照組（PV）。結(jié) 論 安賀拉滴眼液可以降低兔眼表的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)杯狀細(xì)胞增殖，在干眼癥治療 方面具有一定的應(yīng)用前景?！娟P(guān)鍵詞】安賀拉滴眼液；干眼癥；

2、兔；免疫病理學(xué)Abstractobjective To discuss the mecha nism of ketorolac tromethmine eye drops in rabbits dry eye with alkali burns in conjunctiva by observ ing the immunop athologic p rocess after it was used. Methods Twenty rabbit models were established by burning with alkali in conjun ctiva, and the n di

3、vided in to two groups ran domly: the exp erime ntal group treated with ketorolac tromethm in eeye drops and the con trol group treated with saline. By using immunopathologic techniques and impression cytology test, density of goblet cell, positive rate of MUC5ACnd density of inflammatory cell incon

4、junctivawere studied the 4th week after drugused. Result The den sity of goblet cell, and po sitive rate of MUC5AC in exp erime ntal group was higher tha n that of con trol group and lower in the den sity of in flammatory cell（ Pv）. Con clusi on Ketorolac tromethmi ne eye drops can reduce ocular sur

5、face in flammati on and in crease the nu mber of goblet cells in rabbits, suggest ing it is valuable to dry eye.Key words: ketorolac tromethmine;dry eye;rabbit;immunopathology 干眼是指任何原因引起的淚液質(zhì)或量及動力學(xué)的異常，導(dǎo)致淚膜不穩(wěn)定 和（或）眼表面的異常，并伴有眼部不適癥狀的一類疾病。干眼的主要癥狀有眼部 干燥、異物感、視疲勞、畏光及視力下降等，輕者影響工作和生活，嚴(yán)重者可導(dǎo)致 眼表尤其是角膜組織干燥、融解、穿孔，

6、嚴(yán)重危害視功能。干眼作為最常見眼表 疾病有日趨增多的趨勢，其藥物治療方法多種：淚液替代療法、黏液溶解藥、局部 自家血清、抗生素等。隨著干眼發(fā)病機(jī)制的深入研究，現(xiàn)已認(rèn)識到由炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與幾乎所有類型干眼的病理生理過程。本研究采用新型藥物一一安賀拉滴眼液作用兔干眼模型，研究其療效及可能的作用機(jī)制。1材料與方法主要儀器與試劑Leica MEL53型眼科手術(shù)顯微鏡（瑞士 WILDLEITZ 公司"2 5CS1型裂隙燈顯微鏡（蘇州醫(yī)療儀器廠）,Olympus 1OAK照相顯微鏡 （日本歐林巴斯光學(xué)公司），低溫恒冷切片機(jī)（美國Leica公司）,安賀拉滴眼液 （Acular,美國All

7、ergan 公司產(chǎn)品）,16mmX 6mm的濾紙條，1mol/L的NaOH廣州化 學(xué)試劑廠）,1%熒光素鈉溶液,1%虎紅溶液（廣西梧州制藥股份有限公司）,免疫組 化試劑盒和MUC5A抗體（美國Sigma公司）。動物選擇與分組健康成年新西蘭白兔20只，雌雄各半,體質(zhì)量-kg。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組10只，右眼為實(shí)驗(yàn)眼。購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn) 動物中心，合格證號:SCXK （粵）20XX-0002,粵監(jiān)證字20XXA001實(shí)驗(yàn)方法50 mg/2 mL鹽酸氯丙嗪+100 mg/2 mL氯氨酮肌肉注射麻醉兔，切除右眼第三眼瞼，并用2張16 mmX 6 mm的濾紙條蘸1 mol/L的NaOH 溶液置于

8、距兔角膜緣上方2 mm的結(jié)膜上,90 s后立即用100 mL生理鹽水反復(fù)沖 洗結(jié)膜囊。術(shù)后對照組局部應(yīng)用生理鹽水滴眼，每日3次;實(shí)驗(yàn)眼局部應(yīng)用安賀拉 滴眼液,每日3次。用藥4周后行結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)檢查，并取病變區(qū)結(jié)膜行組織病 理學(xué)檢查和免疫組化染色檢測特異性黏蛋白MUC5A的表達(dá)。印跡細(xì)胞學(xué)檢查及PAS染色將孔徑為卩m的醋酸纖維膜剪成3 mmX 3 mm大小，浸入蒸餾水34 h,以消除濾紙表面活性，取出晾干高壓消 毒備用。檢查前結(jié)膜囊先滴1%愛爾卡因1滴,5 min后,濾紙吸去穹隆部淚液，將 醋酸纖維膜的粗糙面貼于距上方角膜緣 2 mm的球結(jié)膜表面，輕輕加壓,35 s之 后撕下，然后于其左右相鄰

9、的區(qū)域再各貼一張，© =95%乙醇固定1030 min,然后 依次用高碘酸氧化，過碘酸希夫染色劑（periodic acid Schiff staining,PAS） 染色，偏重亞硫酸漂洗，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明，中性樹脂封片，置于雙目光學(xué)顯 微鏡下觀察上皮細(xì)胞的連接，胞核胞漿的顏色，核漿比例（N/C）,上皮細(xì)胞角化以 及杯狀細(xì)胞密度。組織病理學(xué)檢查用藥4周取病變部位球結(jié)膜，生理鹽水沖洗干凈后放入10%P醛固定液固定。流水沖洗固定組織過夜。依次進(jìn)行乙醇梯度脫 水，© =70%S醇15 s,80%、90% 95% 100%L醇各3 h。二甲苯透明3次，每次 10 min。從低

10、熔點(diǎn)石蠟到高熔點(diǎn)石蠟浸蠟共 3次,每次1 h。將浸蠟后的組織放 入包埋盒內(nèi)，倒入熔化的高效切片石蠟，待凝固后取出石蠟塊。將石蠟塊安裝在切 片機(jī)的組織固定架上用，調(diào)節(jié)切片厚度在46卩m每個石蠟塊切23張切片。免疫組織化學(xué)染色將組織片放入20 C溫水中展開，貼于玻片上， 放入烘箱內(nèi)烘干5 min,依次放入二甲苯脫蠟和95匯醇各2次,每次1 min。PBS( mol/L, PH )漂洗 3 min X 3;4 'Cl% Tris Tri ton 100 通透 5 mi n,用 PBS 漂洗3 min x 3;加20卩L即用型過氧化物酶阻斷劑于室溫下孵育10 min,用PBS漂洗3 min x

11、 3,以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；加20卩L非免疫動物血清于 室溫孵育5 min,以減少非特異性背景染色；傾去血清吸去多余液體，滴加一抗 (MUC5AC于 4 C孵育12 h,用PBS漂洗3 min x 3;加20卩L生物素標(biāo)記的二抗， 于室溫下孵育10 min,用PBS漂洗3 min x 3;加20卩L辣根過氧化物酶標(biāo)記的 鏈霉卵白素于室溫下孵育10 min,用PBS漂洗3 min x 3;加新鮮配制的DAB顯色 液顯色,顯微鏡下觀察結(jié)果,12 min水洗終止反應(yīng)；蘇木素復(fù)染核1530 min,染 色過深者用鹽酸酒精漂洗；每一批實(shí)驗(yàn)均設(shè)有陽性及空白對照，陽性對照：采用已 知陽性的胃癌切片(

12、由試劑公司提供);空白對照：以PBS代替一抗。結(jié)果判定印跡結(jié)膜杯狀細(xì)胞觀測分級根據(jù)NELSONS分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級:0級:結(jié)膜上皮細(xì)胞形態(tài)正常，層次大小一致，胞漿藍(lán)綠色,N/C為1 : 2,杯狀細(xì)胞密 集分布;1級:結(jié)膜上皮細(xì)胞輕度擴(kuò)大，胞漿藍(lán)綠色,N/C為1 : 3,杯狀細(xì)胞開始減 少密度下降;2級:所有結(jié)膜上皮細(xì)胞均擴(kuò)大，變扁平,胞漿藍(lán)綠色或粉紅色,N/C 為1 : 4或1 : 5,輕度角化。杯狀細(xì)胞明顯減少;3級:結(jié)膜上皮細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)顆 粒狀物質(zhì),核固縮崩解，上皮細(xì)胞胞漿呈粉紅色,N/C為1 ：6或1 : 8,出現(xiàn)不同程 度的角化，杯狀細(xì)胞完全喪失，視野下不見杯狀細(xì)胞。結(jié)膜杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)方法

13、：計(jì)算每個動物所取3張標(biāo)本中共10個高倍鏡(400 x)下杯狀細(xì)胞數(shù)目總數(shù)的平均 值。MUC5A陽性細(xì)胞檢測MUC5AC日性細(xì)胞內(nèi)有棕黃色顆粒,隨機(jī)統(tǒng)計(jì)100個結(jié)膜上皮細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)膜炎性細(xì)胞浸潤程度判定蘇木素復(fù)染核顯示炎性細(xì)胞胞核，以每高倍視野下炎性細(xì)胞數(shù)目來判定結(jié)膜結(jié)締組織中炎性細(xì)胞的浸潤密度。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析(one ivay A.NOVA)及均數(shù)多重比較檢驗(yàn)分析觀察期各指標(biāo)的變化及組間各指標(biāo) 平均值的差異,以P為差異有顯著性。2 結(jié)果用藥4周后,對照組結(jié)膜杯狀細(xì)胞為2級,安賀拉組為1級;對照組結(jié)膜 炎性細(xì)胞浸潤密度高于安賀拉組,杯狀細(xì)胞密度、MU

14、C5A陽性細(xì)胞率均小于安賀 拉組(見表1,圖1,圖2)。表1兩組結(jié)膜病理學(xué)檢測指標(biāo)比較(略)Comp aris on of p athologic cha nges in conjun ctiva betwee n twogroups與對照組比較：*P；*Pv圖1安賀拉組結(jié)膜杯狀細(xì)胞 MUC5A免疫組織化學(xué)染色（X 200）（略）Fig. 1MUC5A（immunohistochemical staining of goblet cell in1110 group treated with koborolcie Lromolh mine（X200）圖2對照組結(jié)膜杯狀細(xì)胞 MUC5A免疫組織化學(xué)

15、染色（X 200）（略）Fig. 2MUC5AC immun ohistochemical sta ining of goblet cell inthe control group （ X 200）3 討論干眼癥患者因杯狀細(xì)胞減少，不能不斷地產(chǎn)生和分泌黏液，使結(jié)膜囊保 持的潤滑度下降，眼瞼與眼球間活動的摩擦力升高，淚膜的更新和穩(wěn)定下降，無法 維持結(jié)膜和角膜的生理性潮濕和潤澤，從而出現(xiàn)一系列眼部不適的癥狀和體征。 長期在空調(diào)開放、空氣不流通的環(huán)境里工作或經(jīng)常從事注意力集中的工作或活動 如長時間使用電腦，在熒光屏前工作、閱讀的人容易引起干眼癥。研究表明,所有類型的干眼均與炎癥有關(guān)。干眼所促發(fā)的是一

16、類非感染 性、免疫相關(guān)性的炎癥反應(yīng)，是在各種致炎因素的刺激下，眼局部出現(xiàn)的防疫性反 應(yīng)。安賀拉是一種新型非甾體抗炎藥，其通過抑制環(huán)氧化酶而阻斷花生四烯酸來 抑制前列腺素的合成；穩(wěn)定肥大細(xì)胞，抑制組織胺、前列腺素等化學(xué)介質(zhì)的釋放； 阻斷炎性介質(zhì)對眼部的刺激和損害，發(fā)揮較強(qiáng)的抗炎作用。本研究應(yīng)用安賀拉滴 眼液治療兔干眼模型，研究其療效及可能的作用機(jī)制。淚膜由外至內(nèi)分為3層:脂質(zhì)層、水液層和黏蛋白層。黏蛋白層對于淚 膜的形成起著至關(guān)重要的作用。黏蛋白有極強(qiáng)的親水性，它主要的功能是覆蓋角 膜上皮,從而賦予了角膜的可濕潤性。眼表的黏蛋白包括角結(jié)膜上皮分泌的跨膜 蛋白WJC 1、2、4,杯狀細(xì)胞上皮分泌的

17、分泌型蛋白質(zhì)訓(xùn)K； 5,以及由淚腺分泌 的水溶型分泌性蛋白MUC7 MUC5A是構(gòu)成淚膜黏蛋白層的最主要成份。這些黏 蛋白,尤其是MUC5AC被認(rèn)為對于促進(jìn)淚膜在眼表的分布、維持淚膜的穩(wěn)定性至 關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示,用藥4周后,安賀拉組MUC5A陽性細(xì)胞數(shù)明顯多于對 照組,且其炎性細(xì)胞浸潤程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對照組。印跡細(xì)胞學(xué)檢查是一種簡便易行、無創(chuàng)傷、可重復(fù)性好的眼表細(xì)胞學(xué)檢 查方法，間接反映杯狀細(xì)胞的分布和數(shù)量。通過印跡細(xì)胞學(xué)檢查，用藥4周后,安賀拉組結(jié)膜上皮細(xì)胞輕度擴(kuò)大，N/C為1 : 3,杯狀細(xì)胞為1級;而對照組結(jié)膜上皮 細(xì)胞擴(kuò)大變扁平，N/C為1 : 4或1 : 5,輕度角化，杯狀細(xì)胞為2

18、級;安賀拉組杯 狀細(xì)胞密度也大于對照組。綜上所述,安賀拉滴眼液可減輕眼表的炎癥反應(yīng)，在干眼的治療方面具 有一定的應(yīng)用前景。本研究結(jié)果提示安賀拉滴眼液可能對杯狀細(xì)胞有作用。但這 種作用是安賀拉滴眼液本身促進(jìn)杯狀細(xì)胞增殖，還是因?yàn)檠劬植垦装Y反應(yīng)減輕， 改善細(xì)胞外環(huán)境而使杯狀細(xì)胞增殖，有待于進(jìn)一步研究探索?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】劉祖國，楊文照.干眼的發(fā)病機(jī)制J.眼科，20XX, 14(5):342-345.陳劍,劉小勇,陳敏.干眼的藥物治療進(jìn)展J.中國實(shí)用眼科雜志,20XX,24(10):1014-1017.宋麗紅,金秀英,孫旭光,等.干眼癥結(jié)膜印跡細(xì)胞學(xué)研究J.眼視光學(xué)雜志，1999, 1(3): 155-158.P FLUGFELDER S C. An tii nflammatory thera py for dry eyeJ. Am JOp hthalmol, 20XX, 137(2):337-342.ABRARA