肺癌組織中miRNAs的表達(dá)及其與Oct4、Klf4的關(guān)系

1、肺癌組織中miRNAs的表達(dá)及其與 Oct4、Klf4的關(guān)系研究肺癌組織中miRNAs的表達(dá)及其與Oct4、Kruppel樣方法 選擇20XX年4月20XX年8月期間在南京軍區(qū)福摘要目的因子(Klf4 )的關(guān)系。州總醫(yī)院接受肺癌根治術(shù)的50例患者進(jìn)行研究，收集肺癌組織和癌旁正常組織， 檢測(cè) Oct4、Klf4 的 mRNA含量以及 miR-335、miR-3、miR-361、miR-200c、miR-148、 miR-29的表達(dá)量，分析 Oct4、Klf4的mRN含量與miRNAs表達(dá)量的關(guān)系。結(jié)果 肺癌組織中Oct4的mRN含量()高于癌旁正常組織的(), t= , P關(guān)鍵詞肺癌；micro

2、RNA Oct4 ； Kruppel樣因子中圖分類號(hào)文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A 文章編號(hào)1673-7210 (20XX 01 ( b)-0100-04Abstract Objective To study the exp ressi on of miRNAs in lung cancer and its correlation with Oct4, Klf4. Methods 50 cases of patients received lung resect ion in Fuzhou Gen eral Hosp ital of Nanji ng Military CommanfTom April 20XX

3、to August 20XXwere enrolled.Lung cancer tissueand adjace nt normol tissues were collected. The n mRNA： ontents of Oct4, Klf4 and miR-335, miR-3 , miR-361 , miR-200 , miR-148 , miR-29 expression levels were detected , the correlati on betwee n mRNA contents of Oct4 Klf4 and miRNAs exp ressi on were a

4、n alyzed. Results mRNA contents of Oct4() in adjace nt normal() in lung can cer were higher tha n those tissue (t= , P? Key words Lung cancer ； MicroRNA； Oct4 ； Klf4肺癌是我國(guó)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，手術(shù)切除仍是臨床治療肺癌最有效 的方式，輔助以術(shù)后放化療、生物靶向治療等措施能夠有效地延長(zhǎng)患者的生存時(shí) 間。盡管如此，患者在接受綜合治療措施后的復(fù)發(fā)率仍較高，復(fù)發(fā)病灶對(duì)放化療以及生物靶向藥物不敏感會(huì)導(dǎo)致病情迅速發(fā)展，最終造成死亡。目前，肺

5、癌發(fā)病的潛在分子機(jī)制仍未闡明。Oct4和Kruppel樣因子4 (Klf4 )是參與細(xì)胞增殖調(diào) 控的兩類轉(zhuǎn)錄因子，與多種惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)1-2，檢測(cè)肺癌組織中Oct4和Klf4的表達(dá)量、探索上游調(diào)控機(jī)制有助于闡明肺癌發(fā)生的分子機(jī)制。近年來 有研究顯示，miRNAs表達(dá)異常與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)并且能夠通過與 mRNA3UTR區(qū)域結(jié)合來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，可能參與Oct4和Klf4表達(dá)的調(diào)控3-4。 本研究分析了肺癌組織中 miRNAs表達(dá)量及其與Oct4、Klf4表達(dá)量的關(guān)系。15 s，特異性退Oct4、Klf4，擴(kuò)miRNA提取試劑 盒抽提組織中的總miRNA采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)miRNA進(jìn)行

6、加尾處理、取加 尾樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并得到 miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA而后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，退 火溫度參照試劑盒均為60r，擴(kuò)增條件如下：95C變性，15 s，60r退火和延 伸，35 s，重復(fù) 40 個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增基因包括 miR-335、miR-3、miR-361、miR-200c、 miR-148、miR-29，擴(kuò)增引物見表1。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入和分析，兩組間比較采用 間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用 以P2結(jié)果肺癌組織和癌旁正常組織中 Oct4、Klf4的表達(dá)量 肺癌組織中Oct4的mRNA含量高于癌旁正常組織，Klf4t檢驗(yàn)，二組P

7、ears on 檢驗(yàn)，的mRN含量低1資料與方法研究對(duì)象選擇20XX年4月20XX年8月在南京軍區(qū)福州總醫(yī)院胸外科接受肺癌根治術(shù)的50例患者進(jìn)行研究，所有患者經(jīng)病理學(xué)檢查診斷為肺癌，包括男 32 例、女18例，年齡4367歲，平均（）歲。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn) 后告知研究事項(xiàng)和手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，取得患者知情同意后進(jìn)行肺癌根治術(shù)。術(shù)中取肺癌 組織和癌旁正常組織，經(jīng)病理檢查確認(rèn)肺癌組織和癌旁正常組織的性質(zhì)后用于下 一步研究。研究材料RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量 PCR試劑盒來自日本 Takara公司；miRNA提取試劑盒、miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒 來自德國(guó)Q

8、igen公司；PCF儀來自美國(guó)ABI公司。研究方法RNA抽提和檢測(cè)方法取肺癌組織和癌旁組織，采用 RNA提取試劑盒抽 提組織中的總RNA采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、通過 OligoDT18將mRN反轉(zhuǎn)錄為 cDNA而后進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，擴(kuò)增條件如下：95r變性， 火溫度，15 s，72r延伸25 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增基因包括 增引物及特異性退火溫度見表1。miRNA抽提和檢測(cè)方法取肺癌組織和癌旁組織，采用于癌旁正常組織，肺癌組織和癌旁正常組織中Oct4、Klf4表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P不同TNM分期肺癌組織中Oct4、Klf4的表達(dá)量檢驗(yàn)示不P不同TNM分期肺癌組織中Oct4、

9、Klf4的mRNA含量有差異，t 同TNM分期肺癌組織中Oct4、Klf4表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均不同分化程度肺癌組織中Oct4、Klf4的表達(dá)量檢驗(yàn)示不不同分化程度肺癌組織中 Oct4、Klf4的mRNA含量有差異，t 同分化程度肺癌組織中Oct4、Klf4表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均肺癌組織和癌旁組織中 miRNAs的表達(dá)量肺癌組織中miR-335、miR-3、miR-361的表達(dá)量低于癌旁正常組織， miR-200c、miR-148、miR-29的表達(dá)量高于癌旁組織。肺癌組織和癌旁正常組織 中miRNAs表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P肺癌組織中miRNAs表達(dá)量與Oct4、K

10、lf4的mRNA勺相關(guān)性肺癌組織中 miR-335、miR-3、miR-361的表達(dá)量與 Oct4的mRNA含量呈 負(fù)相關(guān)（P3討論Oct-4蛋白由Pou5f1基因編碼，是一類含有Pou結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì) 于維持胚胎干細(xì)胞的多能性和自我更新性具有重要意義。最初關(guān)于Oct-4的研究 多集中在尚未分化的細(xì)胞，該轉(zhuǎn)錄因子既能夠使某些細(xì)胞繼續(xù)處于未分化狀態(tài)， 又能使某些細(xì)胞向某一類型細(xì)胞分化。近年來的多項(xiàng)研究提示，Oct-4高表達(dá)與已分化體細(xì)胞的無限增殖有關(guān)，進(jìn)而參與乳腺癌、宮頸癌、胃癌、肺癌等惡性腫 瘤的發(fā)生過程7-9。本研究對(duì)肺癌組織中Oct-4表達(dá)量的檢測(cè)顯示，肺癌組織 中Oct-4的mRN含

11、量高于癌旁組織；且腫瘤的分化程度越低，Oct-4的mRN含量越高，腫瘤的TNM分期越高，Oct-4的mRN含量越高。Klf4 是真核細(xì)胞內(nèi)特有的一類含有3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，能夠識(shí)別 SP1的GC結(jié)合位點(diǎn)并進(jìn)行 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合、抑制SP1下游靶基因CyclinD1的表達(dá)，進(jìn)而阻遏細(xì)胞周期的發(fā)展 以及細(xì)胞的增殖。近年來越來越多的研究將Klf4視作腫瘤抑制因子，胃癌、食管癌等消化道惡性腫瘤的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn) Klf4低表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)展有關(guān) 11-12。本研究采用與Oct4相同的方法對(duì)肺癌組織中Klf4表達(dá)量的檢測(cè)顯示， 肺癌組織中Klf4的mRNA含量低于癌旁組織；且分化程度越低，Klf4的mRN含

12、 量越低，腫瘤的TNM分期越高，Klf4的mRN含量越低。通過以上對(duì)Oct4和Klf4表達(dá)量的分析可知，Oct4高表達(dá)和Klf4低表 達(dá)與肺癌的發(fā)生以及病情的進(jìn)展相關(guān)。 但是，目前關(guān)于兩種轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量發(fā)生 變化的分子機(jī)制仍處于未知狀態(tài)。microRNA是近年來興起的表觀遺傳學(xué)調(diào)控分 子，能夠通過與mRNA勺3 UTR區(qū)域結(jié)合來調(diào)節(jié)多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)13。為了 探明肺癌組織中miRNAs是否參與Oct4和Klf4表達(dá)的調(diào)控，首先對(duì)Oct4和Klf4 mRN的 3 UTR序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，在 Oct4 mRNA的 3 UTR上有miR-125b、miR-145、miR-200c、miR-

13、302、miR-324、miR-335、miR-3、miR-430、 miR-449a、miR-595 的結(jié)合位點(diǎn)，在 Klf4 mRNA勺 3 UTR上有 miR-10b、miR147 miR-199、miR-205、miR-221的結(jié)合位點(diǎn)。由此推測(cè)上述 miRNAs可能通過調(diào)節(jié) Oct4和Klf4的表達(dá)，進(jìn)而參與肺癌的發(fā)生。在上述生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上，本研究查閱了有關(guān)肺癌組織中miRNAs表達(dá)變化的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織中miR-335、miR-3、miR-361、miR-200c、miR-200c、miR-148、miR-29的表達(dá)異常14-20。進(jìn)一步對(duì)肺癌組織中 miRNAs的表

14、達(dá)量進(jìn) 行了驗(yàn)證并分析了 miRNAs含量與相應(yīng)靶基因Oct4、Klf4的相關(guān)性，檢測(cè)和分析 的結(jié)果顯示，肺癌組織中miR-335、miR-3、miR-361的表達(dá)量低于癌旁組織且與 Oct4的mRN含量呈負(fù)相關(guān)，miR-200c、miR-148、miR-29的表達(dá)量高于癌旁組 織且與Klf4的mRNA量呈負(fù)相關(guān)。這就初步提示肺癌組織中 miR-335、miR-3、 miR-361的低表達(dá)可能通過增加Oct4的表達(dá)來參與疾病的發(fā)生， miR-148、miR-29的高表達(dá)可能通過減少 Klf4的表達(dá)來參與疾病的發(fā)生。綜上所述，得出以下初步結(jié)論，肺癌組織中 miR-335、miR-3、miR-36

15、1 及miR-200c、miR-148、miR-29可能分別通過上調(diào)或下調(diào) Oct4、Klf4的表達(dá)來 參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。參考文獻(xiàn)Liu L ，Zhang J，F(xiàn)ang C，et al. OCT4 mediates FSH-induced ep ithelial-mese nchymal tran siti on and inv asi on through the ERK1/2 sig nali ng p athway in ep ithelial ovaria n can cer J. Biochem Biop hys Res Commu，20XX 461（ 3）: 525-532.Wa

16、ng Y，Yang C，Gu Q, et al. KLF4 pro motes an gioge nesis by activati ng VEGF sig nali ng in huma n ret inal microvascular en dothelial cells J. PLoS One ，20XX 10（ 6）: e0130341.Ogawa H，Wu X Kawamoto K et al. MicroRNAs induce epigenetic rep rogram ming and supp ress malig nant phenotypes of huma n colon

17、 can cer cells J. PLoS One ，20XX 10（ 5）: e0127119.Tokarz P, Blasiak J. The role of microRNAin metastatic colorectal can cer and its sig nifica nee in can cer progno sis and treatme nt J. Acta Biochim Pol ，20XX 59（ 4）: 467-474.Ta ng YA Che nCHj Sun HS et al. Global Oct4 target ge ne an alysis reveals

18、 novel downstream PTENand TNCgenes required for drug-resistanee and metastasis in lung cancer J. Nucleic Acids Res，20XX 43（3）:1593-1608.Rodriguez E, ChenL, AoMH et al. Expression of transcriptfactorsSALL4 and OCT4 in a subset of non-small cell lung carcinomas（ NSCLCJ. TransI Respir Med，20XX 2 （1）: 1

19、0.Liu T ，Sun B，Zhao X，et al. OCT4 expression and vasculogenic mimicry formatio n p ositively correlate with poor progno sis in huma n breast cancer J. Int J Mol Sci，20XX 15 （11）: 19634-19649. Breyer JP，Dorset DC，Clark TA，et al. An expressed retrogene of the master embry onic stem cell gene P OU5F1 i

20、s associated with p rostate can cer susceptibility J. Am J Hum Genet，20XX 94 （3）: 5-404.劉攏徐阿曼，陸震，等.胃癌及癌前病變組織中Nanog和Oct-4的表達(dá) 及意義J.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，20XX 30 （8）: 880-883.崔晉峰，趙晨燕，曹立勇，等.食管胃交界腺癌和遠(yuǎn)端胃癌 KLF4SP1 表達(dá)的對(duì)比研究J.中國(guó)腫瘤臨床，20XX 41（ 2）： 108-111.張志平，王洲，劉相燕，等.食管癌組織KLF4和Survivin蛋白表Naranjo Go meZM, Bernal JF，Arranz

21、 PG，et al. Alterations in the expression of p53, KLF4, and p21 in neuroendocrine lung tumors J. Arch Pathol Lab Med , 20XX 138 （7）: 936-942.11 及 Cyclin D112達(dá)及其相關(guān)性研究J.中華腫瘤防治雜志，20XX 19（ 6）: 406-409.13 陳琛，孟凡榮，萬海粟，等.MicroRNAs與OCT4基因之間的相互作 用J.中國(guó)肺癌雜志，20XX 18（ 1）： 55-58.14 Li 丫，Zhao W Bao P，et al. miR-3-5p

22、 inhibits cell migration and invasion and maybe associated with the tumor-node-metastasis staging and lymph node metastasis of non-small cell lung can cer J. On col Lett， 20XX 8（2）: 719-725.15 Rani S ，Gately K， Crown J， et al. Global analysis of serum microRNAs as poten tial biomarkers for lung ade no carc- inoma J. Can cer Biol Ther ，20XX 14（ 12）: 1104-1112.16 Gong M ，Ma J，Guillemette R ，et al. miR-335 inhibits small cell lu ng cancer bo ne metastases via IGF-IR and RANKL pathways J.