人酪氨酸羥化酶基因在猴骨骼肌直接注射后的表達(dá)

1、    人酪氨酸羥化酶基因在猴骨骼肌 直接注射后的表達(dá)*        摘要為了對(duì)多途徑治療帕金森病(PD)提供研究依據(jù)，將帶人酪氨酸羥化酶基因的質(zhì)粒pRcTH與脂質(zhì)體混合后直接注射至猴骨骼肌內(nèi)，100d后取注射部位肌肉組織，以地高辛標(biāo)記的hTHRNA探針進(jìn)行Northern雜交，以檢測(cè)該質(zhì)粒在非人靈長類活體骨骼肌組織中表達(dá)的目的基因的mRNA水平。本研究結(jié)果表明，人酪氨酸羥化酶基因在猴體內(nèi)有較高效率的表達(dá)。本研究提示，質(zhì)?？勺鳛榛蛑委煹妮^理想的表達(dá)載體，而骨骼肌

2、細(xì)胞則是一種能攜帶并表達(dá)外源基因的良好靶細(xì)胞。關(guān)鍵詞肌細(xì)胞基因?qū)牖虮磉_(dá)人酪氨酸羥化酶基因非人靈長類 近年來所進(jìn)行的基因治療研究是將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入相應(yīng)的細(xì)胞或組織中，以達(dá)到治療目的。因此，進(jìn)行基因治療的關(guān)鍵是基因?qū)?。目前基因?qū)敕椒ㄖ饕袃深悾阂活愂情g接法，即從體內(nèi)取出靶細(xì)胞在體外轉(zhuǎn)染遺傳物質(zhì)后再植入體內(nèi)2；另一類是直接法，即把遺傳物質(zhì)直接注入作用部位1。目前我們從事的帕金森病(Parkinson disease,PD)基因治療的研究是以間接法為主，即將多巴胺合成限速酶酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)的基因克隆于質(zhì)?；蚰孓D(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體以后轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞(如骨

3、骼肌細(xì)胞)，再移植至大腦紋狀體3，4。對(duì)此，有人進(jìn)行了采用直接注射法的探索性研究5，但對(duì)其實(shí)用性尚有爭(zhēng)議1，如注射后表達(dá)產(chǎn)物的作用范圍是否足夠大，是否會(huì)經(jīng)軸突到達(dá)非病變區(qū)等。由于研究顯示骨骼肌細(xì)胞在長期存活方面優(yōu)于成纖維細(xì)胞4，是較為理想的靶細(xì)胞；其在攜帶外源性目的基因TH基因方向的能力，也已被大量實(shí)驗(yàn)所證實(shí)。因此，本實(shí)驗(yàn)擬將攜帶人TH基因的質(zhì)粒pRcTH直接注射至猴骨骼肌中并觀察其表達(dá)情況，以期為多途徑治療PD提供研究基礎(chǔ)。材料和方法1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本研究使用成年恒河猴1只，雌性，5.37kg(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng))，60%水合氯醛麻醉，手術(shù)暴露左小腿三頭肌，直視下注入帶人TH基因的質(zhì)粒

4、pRcTH(由美國Somatix Therapy公司惠贈(zèng))20g與脂質(zhì)體(lipofectin)(GIBCO)20g的混合物，注射100d后在麻醉下取注射部位肌肉組織約3g。2.總RNA提取用異硫氫酸胍法6提取猴肌肉組織總RNA，同時(shí)提取引產(chǎn)胎兒(孕6月)腎上腺組織的總RNA作為陽性對(duì)照。3.探針制備4.Northern Blot取猴肌及人胎腎上腺的總RNA各3l，進(jìn)行含甲醛凝膠電泳，用真空印跡儀將RNA轉(zhuǎn)運(yùn)至尼龍膜上，120下干烤30min。加雜交液(50%甲酰胺，5×SSC，2%阻滯試劑，0.1%十二烷基肌氨酸，0.02%SDS 20ml/100cm2)，68下1h。再加入含RN

5、A探針100ng的雜交液(2.5ml/100cm2)，68下過夜。洗膜：(1)2×SSC，0.5%SDS，5min 2次；(2)0.1×SSC，0.5%SDS 15min 2次，68；(3)Washing buffer 1min,(4)buffer 30min。加堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗地高辛抗體(用buffer15 000稀釋)振搖30min。buffer 15min 2次，buffer 15min。加顯色底物氯化硝基因氮唑藍(lán)(45l)和5-嗅-4-氯-3-吲哚基磷酸二鈉鹽(35l)(用10ml buffer稀釋)，避光靜置34h。buffer 5min后終止呈色反應(yīng)。

6、60;    1hTH RNA 探針合成線路Fig.1 The route of hTHRNA probe laleling.結(jié)果260/OD280=1.99，根據(jù)OD260計(jì)算總RNA濃度：猴肌0.15g/L,胎兒腎上腺0.1g/L。各取3l于1%甲醛凝膠電脈(30V，1.5h)，結(jié)果如5。4.Northern blot結(jié)果，猴肌及腎上腺均為陽性，說明在猴肌中有人TH基因的mRNA表達(dá)，且與腎上腺中的表達(dá)量基本相當(dāng)(6)。Fig.2Purified fragment from pRcTH and pGEM after digestion (1% Agarose,

7、50V,1.5h) M: DNA/EcoRI,Hind;Lane 1:pGEM(3.17kb) digested by BamHI and Hind;Lane 2: 4.3kb fragment from pRcTH digested by BamHI;Lane 3: 1.8kb fragment from 4.3kb fragment digested by Hind.Fig.3Recombined plasmid pGEMTH. M:DNA/EcoRI,Hind;Lane 1:pGEM/BamHI;Lane 2:pGEMTH/KpnI;Lane 3:pGEMTH/Xhog/L,10g/L,

8、1g/L,0.1g/L respectively)Fig.5Electrophoresis of total RNA extracted from the muscle of the monkey and the fetal adrenal tissue.Lanel:Monkey muscle;Lane 2:Fetal adrenal tissueFig.6Northern blot M:Monkey muscle;A:Fetal adrenal tissue討論如何將目的基因?qū)霗C(jī)體并長期高效表達(dá)，一直是基因治療中的一個(gè)難題。已有一些研究將目的基因克隆于腺病毒載體7，8或質(zhì)粒載體911后，再

9、注射至大鼠肌肉內(nèi)，目的基因有較高水平的表達(dá)。另有一些研究將帶目的基因的重組體與脂質(zhì)體混合5、或與磷酸鈣共沉淀12、或與多聚賴氨酸糖蛋白復(fù)合物混合13，然后注射于肌肉中，也取得了肯定結(jié)果。在對(duì)其他組織的類似研究中發(fā)現(xiàn)，向大鼠其他組織中注射質(zhì)粒，僅心肌組織能吸收并表達(dá)外源基因14，而脾、腎、肝、皮膚、肺、腦等組織則均無表達(dá)或表達(dá)量極低10，15。本實(shí)驗(yàn)將帶有人TH基因的質(zhì)粒pRcTH與脂質(zhì)體混合后，直接注射至猴骨骼肌中，100d后證實(shí)在肌肉組織中有TH基因表達(dá)。這說明活體骨骼肌組織能接受并表達(dá)外源性基因，并可用于基因治療。有研究認(rèn)為，直接注射目的基因到猴骨骼肌中的表達(dá)效率低于大鼠骨骼肌的15，可能

10、提示靈長類動(dòng)物的骨骼肌可能在表達(dá)外源性基因方面比嚙齒類要更困難些，這也說明進(jìn)一步研究人骨骼肌表達(dá)目的基因的能力是必要的。骨骼肌直接吸收表達(dá)外源基因的機(jī)制尚不清楚，推測(cè)可能與其特殊結(jié)構(gòu)即多核、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富等有關(guān)；也可能是由于肌細(xì)胞受損后外源基因得以進(jìn)入10。此外，由于DNA和細(xì)胞表面都帶負(fù)電荷，DNA在帶正電荷的脂質(zhì)體包裹下，容易與細(xì)胞接近，或脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合，或整個(gè)被細(xì)胞所吞噬，使目的基因通過細(xì)胞本身的機(jī)制整合到核內(nèi)5。骨骼肌細(xì)胞能吸收直接注射的靶DNA這一特性，使直接肌肉注射可能作為基因治療肌肉疾病的給藥途徑8，9，達(dá)到簡便、安全及給藥間隔期相對(duì)較長的目的。此外，由于骨骼肌供血豐富，可將

11、某些作用于全身的激素或酶的基因?qū)牍趋兰〖?xì)胞，使它們作為“生產(chǎn)基地”并通過血流運(yùn)輸至全身，以治療相應(yīng)疾病。這些都有待于對(duì)骨骼肌細(xì)胞更深入更廣泛的研究。在基因治療的載體選擇上，許多學(xué)者傾向于采用病毒載體。病毒載體確有表達(dá)效率高、持續(xù)時(shí)間長的優(yōu)越性，但使用病毒具有直接毒性、抗原性及潛在致癌的風(fēng)險(xiǎn)1。而質(zhì)粒載體則有較高的安全性4，根據(jù)本研究結(jié)果也具有相當(dāng)高的表達(dá)效率并持續(xù)3個(gè)月以上，因而可能較病毒載體具有更好的應(yīng)用前景。收稿1997-7修回1997-11參考文獻(xiàn)1Karpati G.Lochmuller H,Nalbantoglu J,et al.The principles of gene the

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