蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)

1、實驗二實驗二蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)一、免疫學(xué)一、免疫學(xué)n研究研究抗原物質(zhì)抗原物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能；的結(jié)構(gòu)和功能；n免疫應(yīng)答產(chǎn)物免疫應(yīng)答產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能；的結(jié)構(gòu)和功能；n抗原刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的抗原刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的規(guī)律規(guī)律。n免疫學(xué)的研究范圍很廣，與很多相關(guān)學(xué)科交織在免疫學(xué)的研究范圍很廣，與很多相關(guān)學(xué)科交織在一起，并且發(fā)展成了很多學(xué)科，如免疫生物學(xué)、一起，并且發(fā)展成了很多學(xué)科，如免疫生物學(xué)、免疫遺傳學(xué)、血液免疫學(xué)、腫瘤免疫學(xué)等。免疫遺傳學(xué)、血液免疫學(xué)、腫瘤免疫學(xué)等。n隨著免疫生物學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)在隨著免疫生物學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)在高等動物體高等動物體內(nèi)存在內(nèi)存在著具有免疫功能的

2、組織結(jié)構(gòu)（即著具有免疫功能的組織結(jié)構(gòu)（即免疫系免疫系統(tǒng)統(tǒng)）。）。 淋巴組織淋巴組織免疫活性細(xì)胞免疫活性細(xì)胞免疫活性介質(zhì)免疫活性介質(zhì)免疫系統(tǒng)功能免疫系統(tǒng)功能的生理和病理表現(xiàn)的生理和病理表現(xiàn)功能名稱功能名稱 生理功能生理功能 病理表現(xiàn)病理表現(xiàn)免疫防御免疫防御 清除病原微生物及其它抗原性異物清除病原微生物及其它抗原性異物 超敏反應(yīng)（強）超敏反應(yīng)（強） 免疫缺陷?。ㄈ酰┟庖呷毕莶。ㄈ酰┟庖咦苑€(wěn)免疫自穩(wěn) 清除損傷或衰老細(xì)胞清除損傷或衰老細(xì)胞 自身免疫性疾病自身免疫性疾病免疫監(jiān)視免疫監(jiān)視 清除突變或畸變細(xì)胞清除突變或畸變細(xì)胞 防止腫瘤發(fā)生防止腫瘤發(fā)生 腫瘤或病毒持續(xù)性腫瘤或病毒持續(xù)性 殺傷病毒感染細(xì)胞殺傷

3、病毒感染細(xì)胞 感染感染n當(dāng)當(dāng)外源異體物質(zhì)外源異體物質(zhì)，如細(xì)菌、病毒、蛋白質(zhì)、多，如細(xì)菌、病毒、蛋白質(zhì)、多糖等進(jìn)入動物機體后，可以激活機體免疫系統(tǒng)，糖等進(jìn)入動物機體后，可以激活機體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生對外源物質(zhì)的排除作用，從而保護(hù)機體免產(chǎn)生對外源物質(zhì)的排除作用，從而保護(hù)機體免受外源物質(zhì)的侵害。受外源物質(zhì)的侵害。n機體的這一特異機體的這一特異免疫應(yīng)答免疫應(yīng)答功能的細(xì)胞基礎(chǔ)是淋功能的細(xì)胞基礎(chǔ)是淋巴細(xì)胞。巴細(xì)胞。 n免疫應(yīng)答的類型免疫應(yīng)答的類型（一）（一）固有性免疫應(yīng)答固有性免疫應(yīng)答（innate immune response)innate immune response) 又稱先天性免疫應(yīng)答，非特異性免

4、疫應(yīng)答：是機體又稱先天性免疫應(yīng)答，非特異性免疫應(yīng)答：是機體在種系發(fā)育和進(jìn)化過程中形成的免疫防御功能。在種系發(fā)育和進(jìn)化過程中形成的免疫防御功能。（二）（二）適應(yīng)性免疫應(yīng)答適應(yīng)性免疫應(yīng)答（adaptive immune responseadaptive immune response） 又稱又稱獲得性免疫應(yīng)答獲得性免疫應(yīng)答，特異性免疫應(yīng)答，是機體出，特異性免疫應(yīng)答，是機體出生后通過與抗原物質(zhì)接觸后所產(chǎn)生的一系列防御功能。生后通過與抗原物質(zhì)接觸后所產(chǎn)生的一系列防御功能。（具有特異性、多樣性、記憶性、耐受性、自限性）（具有特異性、多樣性、記憶性、耐受性、自限性） 抗原和免疫原性抗原和免疫原性n抗原（抗

5、原（antigensantigens，AgAg）是指能夠刺激機體免疫活性細(xì)是指能夠刺激機體免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并在體內(nèi)或體外發(fā)生特胞產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。異性反應(yīng)的物質(zhì)。n常見的抗原常見的抗原有蛋白質(zhì)、多糖、磷脂、脂多糖、結(jié)合蛋有蛋白質(zhì)、多糖、磷脂、脂多糖、結(jié)合蛋白質(zhì)、核酸、激素等有機物。白質(zhì)、核酸、激素等有機物。n抗原具有兩方面的特性：抗原具有兩方面的特性：免疫原性（免疫原性（immunogenicityimmunogenicity）和免疫反應(yīng)性（和免疫反應(yīng)性（immunoreactivityimmunoreactivity）。）。q免疫

6、原性（免疫原性（immunogenicityimmunogenicity）是指抗原刺激機體引起免疫應(yīng)是指抗原刺激機體引起免疫應(yīng)答的能力。答的能力。q免疫反應(yīng)性（免疫反應(yīng)性（immunoreactivityimmunoreactivity）是指抗原與相應(yīng)免疫應(yīng)答是指抗原與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物產(chǎn)物( (即抗體即抗體) )在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的能力在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的能力。 抗原的分類抗原的分類n抗原可以分為抗原可以分為完全抗原和半抗原完全抗原和半抗原。n完全抗原完全抗原：具有免疫原性和免疫反應(yīng)性的抗原稱：具有免疫原性和免疫反應(yīng)性的抗原稱為完全抗原（為完全抗原（complete a

7、ntigencomplete antigen） n半抗原：半抗原：只具有免疫反應(yīng)性而無免疫原性的抗原只具有免疫反應(yīng)性而無免疫原性的抗原稱為半抗原（稱為半抗原（haptenhapten），也稱為不完全抗原），也稱為不完全抗原(incomplete antigen)(incomplete antigen)。與蛋白質(zhì)結(jié)合后成為完。與蛋白質(zhì)結(jié)合后成為完全抗原。半抗原能與相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞全抗原。半抗原能與相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。絕大多數(shù)多糖和所有類脂發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。絕大多數(shù)多糖和所有類脂都屬于半抗原。都屬于半抗原。 抗體的種類抗體的種類n抗體（抗體（antibodiesa

8、ntibodies，Ab)Ab)是專門對抗抗原特異是專門對抗抗原特異結(jié)構(gòu)的球蛋白，故也稱為免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的球蛋白，故也稱為免疫球蛋白（immunoglobulins, Ig)immunoglobulins, Ig)。存在于血清、體液。存在于血清、體液中，是構(gòu)成機體免疫作用的主要物質(zhì)。中，是構(gòu)成機體免疫作用的主要物質(zhì)。n免疫球蛋白依據(jù)其理化性質(zhì)及生化性質(zhì)的不同，免疫球蛋白依據(jù)其理化性質(zhì)及生化性質(zhì)的不同，分為五種類型：分為五種類型： IgGIgG、 IgAIgA、 IgMIgM、 IgDIgD和和IgEIgE。n人體血清中人體血清中IgGIgG含量最多，含量最多， IgAIgA次之，次之， IgM

9、IgM較較少，少， IgDIgD和和IgEIgE微量。微量。n抗原抗體反應(yīng)（抗原抗體反應(yīng)（antigen-antibody reactionantigen-antibody reaction）n是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)?？砂l(fā)是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)?？砂l(fā)生于生于體內(nèi)體內(nèi)（in vivoin vivo），也可發(fā)生于），也可發(fā)生于體外體外（in vitroin vitro）。）。n體內(nèi)反應(yīng)可介導(dǎo)吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用；體內(nèi)反應(yīng)可介導(dǎo)吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用；n體外反應(yīng)：可出現(xiàn)體外反應(yīng)：可出現(xiàn)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補體參與的反應(yīng)凝集反應(yīng)、沉淀反

10、應(yīng)、補體參與的反應(yīng)及中和反應(yīng)及中和反應(yīng)等各種不同的反應(yīng)類型。等各種不同的反應(yīng)類型。n因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體的檢測中多采用因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體的檢測中多采用血清作試驗，所以血清作試驗，所以體外抗原抗體反應(yīng)亦稱為血清學(xué)反應(yīng)體外抗原抗體反應(yīng)亦稱為血清學(xué)反應(yīng)（serologic reactionserologic reaction）。）。二、印跡法（二、印跡法（blotting）n印跡法是指將樣品轉(zhuǎn)移到印跡法是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體固相載體上，而后利用相應(yīng)上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。n19751975年，年，Southe

11、rnSouthern建立了將建立了將DNADNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NCNC膜）上，并利用膜）上，并利用DNADNARNARNA雜交檢測特定的雜交檢測特定的DNADNA片段片段的方法，稱為的方法，稱為Southern Southern 印跡法印跡法。n人們用類似的方法，對人們用類似的方法，對RNARNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對RNARNA的印跡分析稱為的印跡分析稱為NorthernNorthern印跡法印跡法，對單向電泳后的，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為WesternWestern印跡法印跡法，對雙向電，對雙向電泳后蛋

12、白質(zhì)分子的印跡分析稱為泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為EasternEastern印跡法印跡法三、蛋白免疫印三、蛋白免疫印跡跡的應(yīng)用的應(yīng)用n免疫印跡法免疫印跡法 (immunoblotting test,IBT)，亦稱酶聯(lián)，亦稱酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法免疫電轉(zhuǎn)移印斑法(enzyme linked immunoelectrotransfer blot,EITBn是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)。相結(jié)合的雜交技術(shù)。n具有分析容量大、敏感度高、特異性強等優(yōu)點。具有分析容量大、敏感度高、特異性強等優(yōu)點。n是是檢測蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布檢測蛋白

13、質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種最常用的的一種最常用的方法。方法。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測技術(shù)蛋白質(zhì)免疫印跡檢測技術(shù)一、實驗?zāi)康囊弧嶒災(zāi)康亩?、實驗原理二、實驗原理三、實驗儀器三、實驗儀器四、操作步驟四、操作步驟五、實驗結(jié)果與分析五、實驗結(jié)果與分析六、思考題六、思考題一、實驗?zāi)康囊弧嶒災(zāi)康膎學(xué)習(xí)掌握動物抗血清的制備原理及技術(shù)學(xué)習(xí)掌握動物抗血清的制備原理及技術(shù)n通過實際操作學(xué)會動物抗血清的制備通過實際操作學(xué)會動物抗血清的制備n掌握掌握WesternWesternblottingblotting的基本原理的基本原理 n熟悉熟悉WesternWesternblottingblotting的實驗操作的實驗操作 二

14、、實驗原理二、實驗原理n第一部分第一部分 動物的常規(guī)免疫及抗血清的制備動物的常規(guī)免疫及抗血清的制備n第二部分第二部分 WesternWesternblotting blotting 檢測抗血清檢測抗血清 n將適當(dāng)?shù)膶⑦m當(dāng)?shù)目乖乖镔|(zhì)注入動物體內(nèi)，經(jīng)過一定時間，動物質(zhì)注入動物體內(nèi)，經(jīng)過一定時間，動物血清中可出現(xiàn)大量特異性抗體，這種含抗體的血清物血清中可出現(xiàn)大量特異性抗體，這種含抗體的血清稱為稱為免疫血清免疫血清。n優(yōu)質(zhì)免疫血清的產(chǎn)生，主要取決于優(yōu)質(zhì)免疫血清的產(chǎn)生，主要取決于抗原的純度抗原的純度和和免疫免疫原性原性，以及，以及動物應(yīng)答的能力動物應(yīng)答的能力。此外，尚需考慮免疫途。此外，尚需考慮免疫

15、途徑、抗原劑量、注射次數(shù)、時間間隔、有無佐劑等因徑、抗原劑量、注射次數(shù)、時間間隔、有無佐劑等因素。素。第一部分第一部分 動物的常規(guī)免疫及抗血清的制備動物的常規(guī)免疫及抗血清的制備（一）多克隆抗體的概念（一）多克隆抗體的概念n抗原通常是由多個抗原決定簇組成的?？乖ǔＪ怯啥鄠€抗原決定簇組成的。n由一種抗原決定簇刺激機體，由一個由一種抗原決定簇刺激機體，由一個B B淋巴細(xì)胞接淋巴細(xì)胞接受該抗原所產(chǎn)生的抗體稱之為單克隆抗體受該抗原所產(chǎn)生的抗體稱之為單克隆抗體（Monoclone antibodyMonoclone antibody）。）。n由多個抗原決定簇刺激機體，相應(yīng)地就產(chǎn)生各種由多個抗原決定簇刺激

16、機體，相應(yīng)地就產(chǎn)生各種各樣的單克隆抗體，這些單克隆抗體混雜在一起各樣的單克隆抗體，這些單克隆抗體混雜在一起就是就是多克隆抗體多克隆抗體。n機體內(nèi)所產(chǎn)生的抗體就是機體內(nèi)所產(chǎn)生的抗體就是多克隆抗體多克隆抗體?？贵w的結(jié)構(gòu)抗體的結(jié)構(gòu)（二）用于免疫的動物（二）用于免疫的動物n由于動物的遺傳性不同，同一抗原對不同動物由于動物的遺傳性不同，同一抗原對不同動物或同種不同品系動物、或不同個體，產(chǎn)生特異或同種不同品系動物、或不同個體，產(chǎn)生特異免疫應(yīng)答的強弱是不同的。因此，進(jìn)行動物免免疫應(yīng)答的強弱是不同的。因此，進(jìn)行動物免疫時，必須選擇對該抗原敏感的、年輕的健康疫時，必須選擇對該抗原敏感的、年輕的健康動物。動物。n

17、常用的實驗動物為羊、家兔、豚鼠和鼠等。一常用的實驗動物為羊、家兔、豚鼠和鼠等。一般為般為6 6個月大小的動物。個月大小的動物。n動物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得動物種類的選擇主要根據(jù)抗原的生物學(xué)特性和所要獲得抗血清數(shù)量?？寡鍞?shù)量。q如要獲得大量的抗體，多采用大動物；如要獲得大量的抗體，多采用大動物；q如要是獲得直接標(biāo)記診斷的抗體，則直接采用本動物；如要是獲得直接標(biāo)記診斷的抗體，則直接采用本動物；q如要獲得間接的標(biāo)記診斷用抗體，則必須用異源動物制備如要獲得間接的標(biāo)記診斷用抗體，則必須用異源動物制備抗體；抗體；q如果難以獲得的抗原，且抗體的需要量少，則可以采用純?nèi)绻y以獲得的抗原

18、，且抗體的需要量少，則可以采用純系小鼠制備。系小鼠制備。n一般實驗室采用的抗體，多用兔和羊制備，因動物反應(yīng)一般實驗室采用的抗體，多用兔和羊制備，因動物反應(yīng)良好，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清。良好，而且能夠提供足夠數(shù)量的血清。 （三）抗原（三）抗原n抗原是多種多樣的，就其化學(xué)成分而言，有蛋白抗原是多種多樣的，就其化學(xué)成分而言，有蛋白質(zhì)抗原、類脂抗原、多糖類抗原和核酸抗原等。質(zhì)抗原、類脂抗原、多糖類抗原和核酸抗原等。n為了獲得較好的抗血清，為了獲得較好的抗血清，最好是選用蛋白質(zhì)抗原最好是選用蛋白質(zhì)抗原。n不同的抗原，其免疫原性的強弱均不相同，這種不同的抗原，其免疫原性的強弱均不相同，這種免疫原性的強

19、弱取決于抗原的分子量、化學(xué)活性免疫原性的強弱取決于抗原的分子量、化學(xué)活性基團(tuán)、立體結(jié)構(gòu)等?；鶊F(tuán)、立體結(jié)構(gòu)等。（四）免疫途徑（四）免疫途徑n免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉免疫途徑有多種多樣，如靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、內(nèi)、皮內(nèi)、皮下皮下、淋巴結(jié)內(nèi)注射等。、淋巴結(jié)內(nèi)注射等。n一般常用一般常用皮下或背部多點皮內(nèi)注射皮下或背部多點皮內(nèi)注射，每點注射，每點注射0.1mL0.1mL左右。左右。n實驗中實驗中0.2mL0.2mL，3 34 4點注射。點注射。n皮下注射皮下注射（五）佐劑（五）佐劑n應(yīng)用佐劑的目的應(yīng)用佐劑的目的是為了提高抗原對機體的是為了提高抗原對機體的免疫原性，從而提高抗體的

20、效價。免疫原性，從而提高抗體的效價。n佐劑主要可分為兩種：一種本身具有免疫佐劑主要可分為兩種：一種本身具有免疫原性，如百日咳桿菌、抗酸桿菌（結(jié)核分原性，如百日咳桿菌、抗酸桿菌（結(jié)核分枝桿菌）以及革蘭陰性桿菌等；另一種本枝桿菌）以及革蘭陰性桿菌等；另一種本身無免疫原性，如氫氧化鋁、磷酸鈣、礦身無免疫原性，如氫氧化鋁、磷酸鈣、礦物油乳劑、表面活性劑等。物油乳劑、表面活性劑等。n目前實踐中常應(yīng)用的佐劑目前實踐中常應(yīng)用的佐劑福氏佐劑福氏佐劑。n福氏佐劑福氏佐劑（Freund adjuvantFreund adjuvant）, , 通常是由羊通常是由羊毛脂毛脂1 1份、石臘油份、石臘油5 5份。這是份。

21、這是不完全福氏佐劑不完全福氏佐劑。n在每毫升不完全佐劑加入在每毫升不完全佐劑加入1 120mg20mg卡介苗就成卡介苗就成為為完全佐劑完全佐劑。（六）免疫方法（六）免疫方法n抗原劑量，首次劑量為抗原劑量，首次劑量為101050g50g，加強免疫的劑量，加強免疫的劑量約為首次劑量的約為首次劑量的1/41/4。n首次免疫時抗原與完全佐劑等體積混合。加強免疫首次免疫時抗原與完全佐劑等體積混合。加強免疫時用不完全佐劑。時用不完全佐劑。n每每2 23 3周加強免疫一次。周加強免疫一次。n在第在第2 2次加強免疫后次加強免疫后2 2周，從耳緣靜脈取周，從耳緣靜脈取2 23mL3mL血，血，制備血清，檢測抗

22、體效價。如未達(dá)到預(yù)期效價，需制備血清，檢測抗體效價。如未達(dá)到預(yù)期效價，需再進(jìn)行加強免疫，直到滿意時為止。當(dāng)抗體效價達(dá)再進(jìn)行加強免疫，直到滿意時為止。當(dāng)抗體效價達(dá)到預(yù)期水平時，即可放血制備抗血清。到預(yù)期水平時，即可放血制備抗血清。 n抗體的產(chǎn)生順序與豐度抗體的產(chǎn)生順序與豐度（七）抗血清的采集與保存（七）抗血清的采集與保存n取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動脈放血，取兔血有兩種方法，一是耳緣靜脈或耳動脈放血，一是頸動脈放血，也可心臟采血。一是頸動脈放血，也可心臟采血。 n小鼠取血。小鼠取血。n收集的血液置于室溫下收集的血液置于室溫下1h1h左右，凝固后，置左右，凝固后，置44下，下，過夜（切勿冰

23、凍）析出血清，離心，過夜（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm,10min4000rpm,10min。在無菌條件，吸出血清，分裝。在無菌條件，吸出血清，分裝（0.050.050.2mL0.2mL），貯于），貯于-80-80以下冰箱，或凍干后以下冰箱，或凍干后貯存于貯存于4 4冰箱保存。冰箱保存。（八）抗血清質(zhì)量的評價（八）抗血清質(zhì)量的評價n在免疫期間，不僅各個不同的動物，而且同一動物在在免疫期間，不僅各個不同的動物，而且同一動物在不同的時間內(nèi)抗血清效價、特異性、親合力等都可能不同的時間內(nèi)抗血清效價、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地采血測試。只有在對抗血發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常地

24、采血測試。只有在對抗血清的效價、特異性、親合力等方面作徹底的評價后，清的效價、特異性、親合力等方面作徹底的評價后，才可使用所取得的抗血清。才可使用所取得的抗血清。 n效價效價 抗血清的效價，就是指血清中所含抗血清的效價，就是指血清中所含抗體的濃度或含量。效價測定的方法常用抗體的濃度或含量。效價測定的方法常用的是的是單向擴(kuò)散免疫法單向擴(kuò)散免疫法，此法對所有的抗體，此法對所有的抗體均適用。均適用。n某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的某些由大分子（如蛋白類）抗原所產(chǎn)生的抗體，可用抗體，可用雙擴(kuò)散雙擴(kuò)散等方法測定。等方法測定。n單向擴(kuò)射免疫法單向擴(kuò)射免疫法： 以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)標(biāo)記抗原混合，

25、以不同稀釋度的抗血清與優(yōu)質(zhì)標(biāo)記抗原混合，孵育孵育24h24h后，測定其結(jié)合率。通常以結(jié)合率為后，測定其結(jié)合率。通常以結(jié)合率為50%50%的的血清稀度和血清稀度和為為效價。效價。q如某抗血清的結(jié)合率為如某抗血清的結(jié)合率為50%時的稀釋度為時的稀釋度為1：15000,則該血清的效則該血清的效價就是價就是1：15000 n制備含有一定濃度抗血清的瓊脂凝膠板（抗體固定不變）。打孔，制備含有一定濃度抗血清的瓊脂凝膠板（抗體固定不變）。打孔，加入不同稀釋度的抗原量，進(jìn)行免疫擴(kuò)散?？乖c相應(yīng)抗體在濃加入不同稀釋度的抗原量，進(jìn)行免疫擴(kuò)散?？乖c相應(yīng)抗體在濃度合適時，則形成清晰的沉淀環(huán)，其直徑大小與所加抗原量成

26、正度合適時，則形成清晰的沉淀環(huán)，其直徑大小與所加抗原量成正比。將已知比。將已知參考抗原形成的沉淀環(huán)繪成曲線，然后以待測標(biāo)本的參考抗原形成的沉淀環(huán)繪成曲線，然后以待測標(biāo)本的沉淀環(huán)直徑查標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出待測抗原的含量。沉淀環(huán)直徑查標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出待測抗原的含量。n雙向擴(kuò)散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴(kuò)雙向擴(kuò)散法：利用大分子抗原和抗體在瓊脂平板上擴(kuò)散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判斷抗血清散，兩者在相交處產(chǎn)生沉淀線，以觀察和判斷抗血清中是否有抗體及其濃度。中是否有抗體及其濃度。雙向免疫擴(kuò)散 免疫擴(kuò)散試驗免疫擴(kuò)散試驗 1 1抗原；抗原；2 27 7為不同稀釋倍數(shù)的抗體為不同稀釋倍數(shù)的抗體分

27、分 子子 雜雜 交交 原原 理理 及及 流流 程程 圖圖樣樣 品品 制制 備備電電 泳泳雜雜 交交轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 膜膜結(jié)果顯示結(jié)果顯示探探 針針 制制 備備第二部分第二部分 WesternWesternblotting blotting 檢測抗血清檢測抗血清 Western BlotWestern Blot原理原理n將通過將通過PAGEPAGE分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NCNC膜或膜或PVDFPVDF膜上；膜上；n然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng)；然后與能特異性識別待檢蛋白的抗體進(jìn)行反應(yīng)；n洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后；洗滌去除沒有結(jié)合的特異性抗體后；n加入標(biāo)記的、能識別特異性抗體的

28、種屬特異性抗加入標(biāo)記的、能識別特異性抗體的種屬特異性抗體，反應(yīng)一段時間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合體，反應(yīng)一段時間后再次洗滌去除非特異性結(jié)合的標(biāo)記抗體；的標(biāo)記抗體；n加入適合標(biāo)記物的檢測試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，加入適合標(biāo)記物的檢測試劑進(jìn)行顯色或發(fā)光等，觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)。觀察有無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)。 n免疫印跡的實驗包括五個步驟：免疫印跡的實驗包括五個步驟：n 固定：蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（固定：蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGEPAGE）并從膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。并從膠上轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。n 封閉：保持膜上沒有封閉：保持膜上沒有抗體抗體的結(jié)合場所，使場所處的結(jié)合場所

29、，使場所處于飽和狀態(tài)，用以避免特殊性抗體單獨結(jié)合到膜上。于飽和狀態(tài)，用以避免特殊性抗體單獨結(jié)合到膜上。l一抗雜交：初級抗體（第一抗體）是一抗雜交：初級抗體（第一抗體）是特異性特異性的。的。n二抗雜交：第二抗體或配體試劑對于初級抗二抗雜交：第二抗體或配體試劑對于初級抗體是特異性結(jié)合并作為指示物。體是特異性結(jié)合并作為指示物。n底物顯色：被適當(dāng)保溫后的酶標(biāo)記蛋白質(zhì)區(qū)底物顯色：被適當(dāng)保溫后的酶標(biāo)記蛋白質(zhì)區(qū)帶，產(chǎn)生可見的、不溶解狀態(tài)的顏色反應(yīng)。帶，產(chǎn)生可見的、不溶解狀態(tài)的顏色反應(yīng)。三、實驗儀器三、實驗儀器n動物的常規(guī)免疫動物的常規(guī)免疫n WesternWesternblotting blotting 檢

30、測抗血清檢測抗血清 動物的常規(guī)免疫動物的常規(guī)免疫n注射器注射器n蝸旋混合器蝸旋混合器四、操作步驟四、操作步驟n動物的常規(guī)免疫動物的常規(guī)免疫n WesternWesternblotting blotting 檢測抗血清檢測抗血清 n抗原的提取與制備抗原的提取與制備 1 1）0.5mg/mL0.5mg/mL菠蘿蛋白酶以菠蘿蛋白酶以0.9%0.9%生理鹽水溶生理鹽水溶解解配置（加少量配置（加少量NaOHNaOH促溶促溶）（周二上、周五）（周二上、周五上）。上）。 2 2）純化的雞卵類粘蛋白（周四上午）純化的雞卵類粘蛋白（周四上午）。 3 3）1mg/mL1mg/mL酪蛋白以酪蛋白以0.9%0.9%生

31、理鹽水溶解生理鹽水溶解配置配置（加少量（加少量NaOHNaOH促溶）促溶） （周四下午）（周四下午）。 動物的常規(guī)免疫動物的常規(guī)免疫苦味酸（以苦味酸（以75%75%乙醇配置）標(biāo)記小鼠乙醇配置）標(biāo)記小鼠標(biāo)記部位標(biāo)記部位組號組號頭頭1左前肢左前肢2左后肢左后肢3背背4右前肢右前肢5右后肢右后肢6左耳朵左耳朵7右耳朵右耳朵8n初級免疫初級免疫：小鼠背部多點皮下注射，：小鼠背部多點皮下注射，0.2mL/0.2mL/只小只小鼠鼠 （1 1）抗原與佐劑的混合：取）抗原與佐劑的混合：取1.5mL1.5mL蛋白與蛋白與1.5mL1.5mL完全佐劑完全佐劑混合，震蕩混勻，制成混合，震蕩混勻，制成油包水油包水的形

32、態(tài)的形態(tài) （2 2）用酒精棉球消毒待注射部位）用酒精棉球消毒待注射部位 （3 3）皮下多點注射，每點注射量應(yīng)小于）皮下多點注射，每點注射量應(yīng)小于0.1mL0.1mL 初級免疫后仔細(xì)觀察小鼠對外源抗原的反應(yīng)，兩初級免疫后仔細(xì)觀察小鼠對外源抗原的反應(yīng)，兩周后進(jìn)行加強免疫周后進(jìn)行加強免疫n加強免疫：初級免疫后兩周進(jìn)行。加強免疫：初級免疫后兩周進(jìn)行。n取取1.5mL1.5mL蛋白與蛋白與1.5mL1.5mL不完全佐劑不完全佐劑混合震蕩混勻，制成油包水混合震蕩混勻，制成油包水的形態(tài)。的形態(tài)。n加強免疫加強免疫：小鼠背部多點皮下注射，：小鼠背部多點皮下注射，0.15mL/0.15mL/只小鼠只小鼠 （1

33、1）用酒精棉球消毒待注射部位）用酒精棉球消毒待注射部位 （2 2）皮下多點注射，每點注射量應(yīng)小于）皮下多點注射，每點注射量應(yīng)小于0.1mL0.1mL。n第二次加強免疫第二次加強免疫：加強免疫一周后進(jìn)行。操作相同。：加強免疫一周后進(jìn)行。操作相同。n第二次加強免疫后一周，即可采血，收集抗血清。第二次加強免疫后一周，即可采血，收集抗血清。n小鼠取血。收集的血液置于室溫下小鼠取血。收集的血液置于室溫下1h1h左右，凝固后，置左右，凝固后，置44下，析出血清，離心，下，析出血清，離心，3000rpm,10min3000rpm,10min。吸出血清，分裝。吸出血清，分裝（0.050.050.2mL0.2m

34、L），貯于），貯于-20-20以下冰箱保存。以下冰箱保存。Western BlotWestern Blot一般流程一般流程n蛋白樣品的制備蛋白樣品的制備nSDSSDSPAGEPAGEl轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜l封閉封閉l一抗雜交一抗雜交l二抗雜交二抗雜交l底物顯色底物顯色轉(zhuǎn)移電泳設(shè)備 Western Westernblotting blotting 檢測抗血清檢測抗血清 轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)膜膜的選擇膜的選擇尼龍膜尼龍膜硝酸纖硝酸纖維素膜維素膜封閉非特異性抗體結(jié)合麻煩封閉非特異性抗體結(jié)合麻煩簡單快速封閉非特異性抗體結(jié)合簡單快速封閉非特異性抗體結(jié)合價格昂貴價格昂貴價格便宜價格便宜特殊要求下的選擇特殊要求下的選擇需要更高的蛋白結(jié)合率需要更高的蛋白結(jié)合率（尼龍膜：（尼龍膜： 480g/cm2