PNH 陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿的流式細(xì)胞術(shù)檢測

1、PNH (paroxysmal nocturnal hemoglobinuria) 是一種罕見的獲得性克隆造血干細(xì)胞疾病。但近年來有增多趨勢。我國北方多于南方。半數(shù)以上發(fā)生在20-40歲青壯年。男性多于女性，與遺傳及種族無關(guān)。本病起病隱襲緩慢，呈慢性過程，以貧血、出血為首發(fā)癥狀者較多，以血紅蛋白尿起病者較少。 血紅蛋白尿 ?睡眠有關(guān)，早晨較重，下午較輕 ?尿液外觀為醬油或紅葡萄酒樣; ?伴乏力、胸骨后及腰腹疼痛、發(fā)熱等 原因 ?因?yàn)檠a(bǔ)體作用最適宜的pH是6.87.O，而睡眠時(shí)呼吸中樞敏感性降低，酸性代謝產(chǎn)物積聚 研究歷史 ? Strubing第一次報(bào)道PNH ? Ham 和Dingle 證明了

2、PNH 患者的紅細(xì)胞在血清酸化條件下，易發(fā)生溶血，這就是現(xiàn)在普遍使用的Ham 實(shí)驗(yàn) ?1983年證實(shí)PNH患者GPI合成異常 ?1993年pig-a基因突變 流式細(xì)胞術(shù) 原理： X染色體上 PIG-A（造血干細(xì)胞經(jīng)獲得性體細(xì)胞基因）突變 導(dǎo)致糖化肌醇磷脂(GPI)錨合成障礙 導(dǎo)致由GPI錨接在細(xì)胞膜上的一組膜蛋白丟失，包括CD16、CD55、CD59等 GPI錨連接蛋白 補(bǔ)體調(diào)接蛋白 衰變加速因子(DAF或CD55)、膜攻擊復(fù)合物抑制因子(MACIF或MIRL或CD59)、補(bǔ)體C8結(jié)合蛋白(HRF或C8bp)、膜輔助蛋白(MCP)。 粘附分子 淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原 -3(LFA-3或CD58)

3、、 Blast-1/ CD48、CD67、CD66。 GPI錨連接蛋白 酶類 紅細(xì)胞乙酰膽堿脂酶 ( AchE )、中性粒細(xì)胞堿性磷酶酸酶 ( NAP )、5外核酸酶 ( CD 73 )。 受體類 中性粒細(xì)胞III型Fc受體 ( FcRIIIb 或CD16 )、單核細(xì)胞分化抗原 ( CD14 )、尿激酶型纖溶酶原激活物受體 ( u-PAR )。 血型抗原 CD55 攜帶的Comer抗原、AchE攜帶的 Yt抗原。 1型細(xì)胞 CD59完全陽性 補(bǔ)體激活途徑 C1 C1 C2,C4 C4b2b (C3轉(zhuǎn)化酶） C3 C3b P （備解素） PC3bBb C3bB (C5轉(zhuǎn)化酶） C4b2b3b或P

4、C3bBb C8 C9 C6C7 C5 C5b C5b678 C5b-9 (MAC) CD59 替代途徑 經(jīng)典途徑 CD55 Ag-Ab 分析 ?1.紅系及粒系FSC/SSC設(shè)門 報(bào)告標(biāo)本中CD55、CD59陰性比例 ?做2030份正常人血樣劃定陽性區(qū)（區(qū)）范圍 ?同型陰性對照界定區(qū)范圍， ?中間的區(qū)域即為區(qū)。 ?根據(jù)CD59可以將PNH細(xì)胞分為3型 ?1型細(xì)胞 CD59完全陽性 正常細(xì)胞 ?2型細(xì)胞 CD59部分陽性 補(bǔ)體中度敏感細(xì)胞 ?3型細(xì)胞 CD59完全陰性 補(bǔ)體敏感細(xì)胞 ?CD55和CD59同時(shí)部分或完全缺失是PNH的典型表現(xiàn)，單GPI缺失不能確診。 ?CD59重要性大于CD55 ?

5、單CD55缺乏時(shí)并不因此改變紅細(xì)胞對補(bǔ)體的敏感性而造成溶血 ?CD59的缺失會增加補(bǔ)體的敏感性 ?臨床上以CD59缺失作為診斷標(biāo)準(zhǔn)是一個趨勢。 ?解決了一切以補(bǔ)體溶血為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)診斷方法在診斷PNH的不確定性 意義 其它細(xì)胞的PNH檢測 ?PNH患者的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞上GPI錨連膜蛋白部分或全部喪失。 ?粒細(xì)胞單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞紅細(xì)胞 ?骨髓PNH克隆出現(xiàn)比外周血早，網(wǎng)織紅細(xì)胞略早于紅細(xì)胞 其它細(xì)胞的PNH檢測 ?應(yīng)用FSC/SSC設(shè)門分析時(shí)會有許多脫顆粒的中性粒細(xì)胞，這時(shí)只使用物理特征無法準(zhǔn)確設(shè)定粒細(xì)胞門了，這時(shí)必須使用系列標(biāo)志/SSC設(shè)門:CD15，CD33 。 ?CD64

6、設(shè)門，分析單核CD14,CD55,CD59， ?PNH病人檢測GPI缺乏的血小板不容易分辨 ?不能只根據(jù)淋巴細(xì)胞上GPI相關(guān)蛋白的表達(dá)來診斷。 與其他實(shí)驗(yàn)比較 1.酸溶血試驗(yàn)(Ham試驗(yàn)) 患者紅細(xì)胞與含5%鹽酸的正常同型血清混合， pH6.4，37孵育2小時(shí)，溶血明顯。本試驗(yàn)特異性高，敏感性差。 2.蛇毒因子溶血試驗(yàn)蛇毒因子能通過補(bǔ)體交替途徑，使補(bǔ)體敏感的紅細(xì)胞發(fā)生溶血。本試驗(yàn)特異性強(qiáng)，敏感性優(yōu)于酸溶血試驗(yàn)。 3.熱溶血試驗(yàn)和蔗糖溶血試驗(yàn) 因特異性差，常作為篩選方法。 具有PNH克隆的血液病 檢測粒細(xì)胞GPI 錨連蛋白表達(dá) 病種 檢測例數(shù) 缺失例數(shù)( % ) AA 115 25 ( 22 %

7、 ) MDS 39 9 ( 23% ) 并發(fā)現(xiàn) MDS有 PNH表達(dá)者 ATG（人胸腺細(xì)胞免人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白）疫球蛋白）治療有效 ( An Intern Med 1999 ，131: 401 ) PNH和AA關(guān)系 相當(dāng)密切，可以相互轉(zhuǎn)化且并存 AAPNH較多(15%)，PNHAA少 20%30% PNH可伴骨髓再障 AA(ATG治療后)PNH 1031% AA-PNH綜合征 16.5%(我國) 50a外周血或骨髓可檢出PNH克隆 AAPNH 生存率要高于PNHAA ?MDS-RA 如撿出PNH克隆者預(yù)后好，且ATG(人胸人胸腺細(xì)胞免疫球蛋白腺細(xì)胞免疫球蛋白 )治療有效。 PNH對AA和MD

8、S的“自然治療”，而“AA救了PNH” 。 PNH 克隆見于淋巴增殖性疾病 檢測病種 例數(shù) NHL 87 HD 55 紅細(xì)胞 CD55/CD59 CLL 49 缺失檢出率 9.2% ALL 22 HCL 4 (Hematol J 2001，2: 33) PNH克隆見于漿細(xì)胞病 檢測紅細(xì)胞 CD55/CD59 缺失 病種 檢測例數(shù) 缺失例數(shù) (%) MM 62 6 WM 7 2 MGUS 6 1 HCD 2 1 合計(jì) 77 10 (12.9%) (Int J Hematol 2002, 75 :40) FLAER ?嗜水氣單胞菌溶素變異體(FLAER)。 ?1998年Diep等報(bào)道嗜水氣單胞菌(

9、HEC)毒素能特異地與細(xì)胞膜上GPI錨連蛋白結(jié)合，隨后立即聚合成多具體，插入細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層，在膜上形成孔洞致溶破。 ?PNH細(xì)胞缺乏GPI蛋白而抵抗毒素保持細(xì)胞完好。 FLAER ?FLAER在所有具有GPI錨連蛋白的白細(xì)胞上都有特異性表達(dá)，所以正常人及非PNH貧血FLAER成100%陽性。 ?是目前診斷PNH最敏感、特異的方法。 ?FLAER對PNH克隆檢出的敏感性為0.1%，其它靶向標(biāo)記檢出率的敏感性為1%； 結(jié)果分析 ?1.設(shè)門 CD45/SSC ?2.標(biāo)記CD15，CD14，CD45，F(xiàn)LAER 檢測PNH粒、單核及淋巴細(xì)胞，報(bào)告標(biāo)本中各系細(xì)胞FLAER陰性比例 FLAER ?目前FLAER一般用于有核細(xì)胞的檢測，不能評價(jià)紅細(xì)胞的PNH克隆。 ?由于紅細(xì)胞表面沒有氣單胞菌溶素前體產(chǎn)生所需要的蛋白水解酶類，盡管表達(dá)在紅細(xì)胞表