分解纖維素的微生物的分離（課堂PPT）

1、12一、基礎知識一、基礎知識（一）纖維素和纖維素酶（一）纖維素和纖維素酶1 1、纖維素、纖維素纖維素是一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子纖維素是一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是地球上含量最豐富的多糖類物質?；衔?，是地球上含量最豐富的多糖類物質。32 2、纖維素的分布、纖維素的分布 棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產物，棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產物，此外，木材、作物秸稈等也富含纖維素。但被利此外，木材、作物秸稈等也富含纖維素。但被利用的機會很少、效率低；用的機會很少、效率低； 科學家正致力于研究，怎科學家正致力于研究，怎樣將農業(yè)廢棄物、木材及生長樣將農業(yè)廢棄物、木材及生長更

2、為迅速的草本植物，更為迅速的草本植物，轉化為轉化為種類繁多的生物燃料種類繁多的生物燃料（甚至是（甚至是航空燃油）。航空燃油）。纖維素生物燃料：纖維素生物燃料：最有希望替代石油能源最有希望替代石油能源4 植物每年產生的纖維素超過植物每年產生的纖維素超過7070億噸，其中億噸，其中40%-60%40%-60%能被能被土壤中能產生土壤中能產生纖維素酶纖維素酶的微生物所利用，不會大量積累。的微生物所利用，不會大量積累。 在草食性動物等的消化道內，也共生有分解纖維素在草食性動物等的消化道內，也共生有分解纖維素的微生物，其原理也是產生的微生物，其原理也是產生纖維素酶纖維素酶而分解纖維素，而而分解纖維素，而

3、人沒有分解纖維素的能力。人沒有分解纖維素的能力。3 3、纖維素酶、纖維素酶 纖維素酶是一種纖維素酶是一種復合酶復合酶，一般認為它至少包，一般認為它至少包括三種組分，即括三種組分，即C1C1酶、酶、CXCX酶和葡萄糖苷酶酶和葡萄糖苷酶，前兩，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。二糖分解成葡萄糖。纖維二糖纖維二糖C1酶、酶、Cx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纖維素纖維素5P27P27：纖維素酶分解纖維素的實驗：纖維素酶分解纖維素的實驗取二支取二支20mL的試管的試管各加入一張濾紙條各加入一張濾紙條各加入各加入pH4.8，物

4、質量為，物質量為0.1mol/L的醋酸醋酸鈉緩沖液的醋酸醋酸鈉緩沖液11ml和和10ml在乙試管中加入在乙試管中加入1mL纖維素酶纖維素酶兩支試管固定在錐形瓶中，放在兩支試管固定在錐形瓶中，放在140r/min的搖床上振蕩的搖床上振蕩1h結果：乙試管的濾紙條消失結果：乙試管的濾紙條消失甲甲 乙乙討論：討論：乙試管的濾紙條為什么會消失？甲試管的作用是什么？乙試管的濾紙條為什么會消失？甲試管的作用是什么？6思考思考實驗分析：實驗分析：P27P27的小實驗是如何的小實驗是如何構成對照的？構成對照的？濾紙崩潰法濾紙崩潰法自變量是纖維素酶的有無：自變量是纖維素酶的有無：一支試管中添加適量纖維素酶溶液，一

5、支試管中添加適量纖維素酶溶液，另一支試管不添加纖維素酶，另一支試管不添加纖維素酶，（但需加入等量的緩沖液，不能加入蒸餾水，（但需加入等量的緩沖液，不能加入蒸餾水，否則會影響溶液的否則會影響溶液的pHpH。）。）7（二）纖維素分解菌的篩選（二）纖維素分解菌的篩選 1 1、篩選方法：、篩選方法： 剛果紅染色法剛果紅染色法，這種方法，這種方法能夠通過顏色反應直接對微生能夠通過顏色反應直接對微生物進行篩選。物進行篩選。2 2、篩選原理：、篩選原理： 剛果紅剛果紅是一種染料，它可以是一種染料，它可以與像纖維素這與像纖維素這樣的多糖物質形成紅色復合物樣的多糖物質形成紅色復合物 ，但并不和纖維，但并不和纖維

6、二糖、葡萄糖發(fā)生這種反應。當纖維素被纖維二糖、葡萄糖發(fā)生這種反應。當纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅素酶分解后，剛果紅纖維素的復合物就無法纖維素的復合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現以纖維素分解為中心的形成，培養(yǎng)基中會出現以纖維素分解為中心的透明圈透明圈 。這樣我們可以通過。這樣我們可以通過是否產生透明圈是否產生透明圈來來篩選纖維素分解菌。篩選纖維素分解菌。8例例1 1 ：下列關于纖維素酶的說法，錯誤的是（：下列關于纖維素酶的說法，錯誤的是（ ）A. A. 纖維素酶是一種復合酶，至少包括三種纖維素酶是一種復合酶，至少包括三種B. B. 纖維素酶可把纖維素分解成葡萄糖纖維素酶可把纖維素分解成葡萄糖C.

7、 C. 纖維素酶可用于去掉植物的細胞壁纖維素酶可用于去掉植物的細胞壁D. D. 葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖葡萄糖苷酶可把纖維素分解成葡萄糖D9二、實驗設計二、實驗設計（一）分離分解纖維素的微生物實驗流程（一）分離分解纖維素的微生物實驗流程土壤土壤取樣取樣選擇選擇培養(yǎng)培養(yǎng)梯度梯度稀釋稀釋將樣品涂將樣品涂布到鑒別布到鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)基挑選挑選菌落菌落什么樣什么樣的環(huán)境的環(huán)境取樣取樣? ? 培養(yǎng)的目的培養(yǎng)的目的? ? 選擇培養(yǎng)基的特選擇培養(yǎng)基的特點點? ?挑選什挑選什么樣的么樣的菌落菌落? ?鑒別培養(yǎng)基的鑒別培養(yǎng)基的特點特點? ?如何鑒別如何鑒別? ?根據：根據：微生物微生物對生存環(huán)境的對生存環(huán)

8、境的要求，到相應要求，到相應環(huán)境中去找；環(huán)境中去找；目的：目的：增加纖維增加纖維素分解菌的濃度，素分解菌的濃度，以確保能夠從樣以確保能夠從樣品中分離到所需品中分離到所需要的微生物；要的微生物；剛果紅染色法剛果紅染色法10本實驗流程與尿素分解菌的分離實驗流程有哪些異同？ 尿素分解菌的分離實驗流程是將土樣制成尿素分解菌的分離實驗流程是將土樣制成的菌懸液直接涂布在選擇培養(yǎng)基上的菌懸液直接涂布在選擇培養(yǎng)基上; ;本課題通過本課題通過選擇培養(yǎng)使細菌增殖后選擇培養(yǎng)使細菌增殖后, ,再涂布在鑒別培養(yǎng)基上。再涂布在鑒別培養(yǎng)基上。其它操作基本基本共同。其它操作基本基本共同。 11分布環(huán)境分布環(huán)境1 1、土壤取樣

9、：、土壤取樣： 生物與環(huán)境的互相依存關系，在富含纖維生物與環(huán)境的互相依存關系，在富含纖維素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對提高，因素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于此從這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。普通環(huán)境。原因原因（二）操作步驟（二）操作步驟12實例實例討論討論 將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，實際上是人工設置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。實際上是人工設置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應將濾紙埋于深約一般應將濾紙埋于深約10cm10cm左右的土壤中。左右的土壤中。樹林中多年落葉形成

10、的腐殖土，多年積累的樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等。枯枝敗葉等。如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認為濾壤中，將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認為濾紙應該埋在土壤中多深？紙應該埋在土壤中多深？132 2、選擇選擇培養(yǎng)培養(yǎng) 增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離所需要的微生物。品中分離所需要的微生物。 目的：目的：制備選擇培養(yǎng)基制備選擇培養(yǎng)基操作：操作：將土樣加入裝有將土樣加入裝有30ml30ml選擇培養(yǎng)基的錐形瓶選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，

11、在一定溫度下震中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下震蕩培養(yǎng)蕩培養(yǎng)1 12 2天，直至培養(yǎng)液變渾濁。也可重復天，直至培養(yǎng)液變渾濁。也可重復選擇培養(yǎng)。選擇培養(yǎng)。14閱讀資料二閱讀資料二“選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基”，回答以下幾問題：，回答以下幾問題：15培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成纖維素粉纖維素粉 5gNaNO3 1gKCl 0.5g Na2HPO47H2O 1.2gKH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g酵母膏酵母膏 0.5g水解酵素水解酵素 0.5g溶解后，蒸餾水定容至溶解后，蒸餾水定容至1000mL碳源（能源）碳源（能源）氮源、無機鹽氮源、無機鹽無機鹽無機鹽碳源、氮源、生長因子碳源、氮源、

12、生長因子氮素、生長因子氮素、生長因子水水提供主要的營養(yǎng)物質提供主要的營養(yǎng)物質16提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基。可用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與之對照選擇培養(yǎng)基。可用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基與之對照, ,或者將纖維素改為葡萄糖?；蛘邔⒗w維素改為葡萄糖。A A、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？為什么？是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑（瓊脂）。是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑（瓊脂）。目的是使纖維素分解菌增殖目的是使纖維素分解菌增殖, ,含量增多含量增多。B B、這個培養(yǎng)基對微生物是否具

13、有選擇作用？如果、這個培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進行選擇的？具有，是如何進行選擇的？有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。只有能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。C C、你能否設計一個對照實驗，說明選擇培養(yǎng)基的、你能否設計一個對照實驗，說明選擇培養(yǎng)基的作用？作用？17分析分析“纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基配方纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基配方”可知，該配方中的酵母膏也能夠提供少量的碳可知，該配方中的酵母膏也能夠提供少量的碳源，因此其他微生物也能在該培養(yǎng)基中生長繁源，因此其他微生物也能在該培養(yǎng)基中生長繁殖。

14、只不過，由于酵母膏的含量極少，因此，殖。只不過，由于酵母膏的含量極少，因此，只有以纖維素為碳源的微生物才能大量繁殖。只有以纖維素為碳源的微生物才能大量繁殖。說明：說明：18在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應適應這種營養(yǎng)條件的微生物得到這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖迅速繁殖，而那些，而那些不不適應適應這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制抑制，因此，因此可以起到可以起到“濃縮濃縮”的作用。的作用。19比較項目比較項目分解尿素的細菌分解尿素的細菌纖維素分解菌纖維素分解菌選選擇擇培培養(yǎng)養(yǎng)基基原理原理培養(yǎng)基培養(yǎng)基類型類型目的目的將細菌涂布在

15、只將細菌涂布在只有尿素做氮源的有尿素做氮源的選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)基上將細菌涂布在只有將細菌涂布在只有纖維素粉做碳源的纖維素粉做碳源的選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基篩選菌株篩選菌株增大菌株濃度增大菌株濃度比較：比較：20本實驗的流程與課題本實驗的流程與課題2 2中的實驗流程有哪些異同？中的實驗流程有哪些異同？ 本實驗流程與課題本實驗流程與課題2 2的流程的區(qū)別如下。課題的流程的區(qū)別如下。課題2 2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為唯一氮以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。本課題得到菌落

16、。本課題通過通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步驟基本一致。 思考：思考：21按照課題按照課題1 1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進行等比稀釋的培養(yǎng)基進行等比稀釋10101 110107 7倍。倍。3 3、梯度稀釋、梯度稀釋101102103104105106224 4、將樣品涂布到、將樣品涂布到鑒別鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上纖維素分解菌的培養(yǎng)基上（1 1）制備鑒別培養(yǎng)基）制備鑒別培養(yǎng)基: :培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基組成提供的主要營養(yǎng)物質提供的主要營

17、養(yǎng)物質CMC-Na 510gCMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g1g碳源、氮源、生長因子碳源、氮源、生長因子KHKH2 2POPO4 4 0.25g0.25g無機鹽無機鹽土豆汁土豆汁 100mL100mL碳源、生長因子碳源、生長因子瓊脂瓊脂 15g15g凝固劑凝固劑上述物質溶解后，加蒸餾水上述物質溶解后，加蒸餾水定容至定容至1000mL1000mL氫元素、氧元素氫元素、氧元素( (水溶性羧甲基纖維素鈉水溶性羧甲基纖維素鈉) )23（2 2）涂布平板：）涂布平板： 將稀釋度為將稀釋度為10104 410106 6的菌懸液各取的菌懸液各取0.1mL0.1mL滴滴加在加在鑒別鑒別纖維素分

18、解菌的培養(yǎng)基上纖維素分解菌的培養(yǎng)基上, ,用涂布器將用涂布器將菌液涂布均勻菌液涂布均勻, ,在在3030倒置培養(yǎng)倒置培養(yǎng)。每個稀釋度下。每個稀釋度下需涂布需涂布3 3個平板個平板, ,還要注意還要注意設置對照設置對照。245 5、剛果紅染色法、剛果紅染色法 挑選產生挑選產生透明圈透明圈的菌落，一般即為分解纖維的菌落，一般即為分解纖維素的菌落。素的菌落。常用的剛果紅染色法有兩種：常用的剛果紅染色法有兩種：方法一：方法一：先先_，再加入剛果紅進行顏色反應。，再加入剛果紅進行顏色反應。方法二：方法二：在在_時就加入剛果紅。時就加入剛果紅。培養(yǎng)微生物培養(yǎng)微生物倒平板倒平板25染染優(yōu)優(yōu)缺缺方方方方顏色反

19、應基本顏色反應基本上是纖維素分上是纖維素分解菌的作用解菌的作用操作繁瑣操作繁瑣剛果紅會使菌落之間剛果紅會使菌落之間發(fā)生混雜發(fā)生混雜操作簡便不操作簡便不存在菌落混存在菌落混雜問題雜問題1.產生淀粉酶的微生物產生淀粉酶的微生物也產生模糊透明圈也產生模糊透明圈2.有些微生物能降解色有些微生物能降解色素，形成明顯的透明圈。素，形成明顯的透明圈。26漂洗作用漂洗作用，洗去與纖維素結合不牢的剛果，洗去與纖維素結合不牢的剛果紅，以免出現的透明圈不夠清晰。紅，以免出現的透明圈不夠清晰。用這方法可用這方法可以判斷酶活力的大小以判斷酶活力的大小，實際上剛果紅是結合到，實際上剛果紅是結合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖

20、維素的細菌可以培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素的細菌可以產生纖維素酶，能分解這個多糖底物成為單產生纖維素酶，能分解這個多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結合上去了，糖，這樣剛果紅就不能結合上去了，氯化鈉溶氯化鈉溶液就可以使結合不牢的剛果紅洗去，這樣就留液就可以使結合不牢的剛果紅洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈當然分解纖下大大小小的透明圈，大的透明圈當然分解纖維素的能就強維素的能就強！ 27比較項目比較項目分解尿素的細菌分解尿素的細菌纖維素分解菌纖維素分解菌鑒鑒定定培培養(yǎng)養(yǎng)基基原理原理現象現象方法方法在細菌分解尿素的化學在細菌分解尿素的化學反應中，細菌合成的脲反應中，細菌合成的脲酶將尿

21、素分解成了氨，酶將尿素分解成了氨，氨會使培養(yǎng)基的堿性增氨會使培養(yǎng)基的堿性增強，強，pH升高。在培養(yǎng)基升高。在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如中加入酚紅指示劑，如果果pH升高指示劑會變紅升高指示劑會變紅剛果紅可以與纖維素形剛果紅可以與纖維素形成紅色復合物，當纖維成紅色復合物，當纖維素被纖維素酶催化分解素被纖維素酶催化分解后紅色復合物無法形成，后紅色復合物無法形成，培養(yǎng)基上就會出現以纖培養(yǎng)基上就會出現以纖維素分解菌為中心的透維素分解菌為中心的透明圈明圈觀察菌落周圍是否有著觀察菌落周圍是否有著色的環(huán)帶出現來鑒定尿色的環(huán)帶出現來鑒定尿素分解菌素分解菌觀察菌落周圍是否出現觀察菌落周圍是否出現透明圈來篩選纖維素

22、分透明圈來篩選纖維素分解菌解菌脲酶檢測法脲酶檢測法剛果紅染色法剛果紅染色法286 6、純化培養(yǎng)、純化培養(yǎng) 挑取產生挑取產生明顯的透明圈的菌落，明顯的透明圈的菌落，一般即為一般即為分解纖維素的菌落。分解纖維素的菌落。 接種到接種到纖維素分解菌的纖維素分解菌的選擇選擇培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)基上，在30300 0C C 37 370 0C C培養(yǎng)，可獲得純培養(yǎng)。培養(yǎng)，可獲得純培養(yǎng)。29三、結果分析與評價三、結果分析與評價對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。培養(yǎng)基制作合格。如果觀察到產生透明圈的菌落，則說明可能獲得如果觀察到產生透明圈的菌落，則

23、說明可能獲得了分解纖維素的微生物。了分解纖維素的微生物。1 1、培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩、培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落選出菌落2 2、分離的結果是否一致、分離的結果是否一致由于在土壤中細菌的數量遠遠高于真菌和放線菌由于在土壤中細菌的數量遠遠高于真菌和放線菌的數量，因此最容易分離得到的是細菌。但由于所取的數量，因此最容易分離得到的是細菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學也可能得到真菌和放線菌土樣的環(huán)境不同，不同同學也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結果。等不同的分離結果。30為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還為了確定分離得到的是纖維素分解菌，還需要進行需要進行_實驗，纖維素酶實驗，纖維素酶的發(fā)酵方法有的發(fā)酵方法有_ _ 發(fā)酵和發(fā)酵和_ _ 發(fā)酵。發(fā)酵。纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖纖維素酶測定方法是對纖維素酶分解濾紙等纖維素所產生的維素所產生的_ _ 含量進行定量測定。含量進行定