水質物質對蚤類(大型蚤)急性毒性測定方法

1、水質物質對蚤類（大型蚤）急性毒性測定方法water qualityDetermination of the acute toxicityof substance to Daphnia （Daphnia magna straus ）GB/T13266-91本標準參照采用國際標準ISO 63411982 «水質 大型蚤運動抑制的測定 。本標準用大型蚤（Daphnia magna straus （Cladocera Crustacea ）為試驗生物。測定物質 或廢水的半數抑制濃度，半數致死濃度（24h-EC50、24h-LC50或48h-EC50、48h LC50）,用于判斷物質或廢水的毒

2、性程度。1適用范圍本標準適用于以下范圍；a.在試驗條件下可溶的化學物質（包括工業(yè)原料和產品、食品添加劑、農藥、醫(yī)藥等）。b.工業(yè)廢水。C.生活污水。d.地表水、地下水。2原理2.1 24h -EC50 48hEC50指在24或48 h內百分之五十的受試蚤運動受抑制時被測物的濃度。2.2 運動受抑制（Immobilization ）反復轉動試驗容器，15s之內失去活動能力的大型蚤，被認為運動受抑制。即使其觸角 仍能活動，也應算做不活動的個體。2.3 24h LC50、40hLC50指在24或48h內百分之五十的受試蚤死亡時被測物的濃度，以受試蚤心臟停止跳動為 其死亡標志。3試驗材料3.1 試驗生

3、物為大型蚤（Daphnia magna straus,甲殼綱，枝尼亞目）。保持良好的培養(yǎng)條件，使大型蚤的繁殖被約束在孤雌生殖的狀態(tài)下（ 見附錄A 。選用實驗室條件下培養(yǎng) 3代以上的、出生624 h的幼蚤為試驗蚤。試驗蚤應是同一母 體的后代。3.2 試驗用水：3.2.1 配制人工稀釋水為試驗用水。新配制的標準稀釋水 PH為7.8±O.2,硬度250±25mg/ L （以CaCOt） Ca/ Mg比例接近4:1 ,溶解氧濃度在空氣飽和值的80 %以上，并不含有任何對大型蚤有毒的物質。人工稀釋水用電導率 10 s/cm （lms/m）以下的蒸儲水或去離子水（以下簡稱水） 按下述方

4、法配制。a.氯化鈣溶液將11.76g氯化鈣（CaC12 - 2H2。溶于水中稀釋至 1L。b.硫酸鎂溶液將4.93g硫酸鎂（MgSO-7H2。溶于水中稀釋至 1L。c. 碳酸氫鈉溶液將2.59 g碳酸氫鈉（NaHCO溶于水中稀釋至 1L。d. 氯化鉀溶液將0.25g氧化鉀（KCI）溶于水中稀釋至 1L。各取以上四種溶液 25mL混合，稀釋至1L。必要時可用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調節(jié)pH值， 使其穩(wěn)定在7.8 ± 0.2 。 標準稀釋水應容許大型蚤在其中生存至少48h， 并盡可能檢查稀釋水中不含有何已知的對大型蚤有毒的物質。例如：氯、重金屬、農藥、氨或多氯聯(lián)苯。3.2.2 如果所進行的

5、試驗需要使用其他稀釋水或改變稀釋水的pH， 應在試驗報告中注明所用的性質。要求稀釋水的硬度在150300 mg/L （以CaCQ計）范田內，CaXMg比例接近4-6.5或不得高于8.5 ,同一試驗pH的波動不得大于 0.5。3.3重銘酸鉀（K2Cr2。），分析純。4 試驗液的制備4.1 試驗物質溶液的配制4.1.1 試驗物質可以是可溶于水的固體、液體或氣體，但要求組分一定，具有代表性、重復性。4.1.2 易溶于水的試驗物質可直接加到稀釋水里，也可以溶解在蒸餾水或去離子水中配成貯備液后，再加人到稀釋水中配成試驗液，每升稀釋水中的貯備液要少于10mL。 貯備液應當低溫保存。4.1.3 難溶于水的物

6、質，可用適當的方法，將其溶解和分散. 包括使用超聲波裝置及其他低毒溶劑增溶。如果使用溶劑，溶劑在試驗液中的濃度不應超過0.5mg L， 并應在試驗的同時設兩個對照組，一組用稀釋水，另一組用最大濃度的溶劑。4.2 工業(yè)廢水試驗液的制備4.2.1 樣品的采集及處理：采集廢水樣品時，應將采樣瓶充滿水樣，不留空氣。樣品采集后應立即進行試驗。如果樣品采集后6h 之內不能進行試驗，則必需將水樣冷凍保存（0-4C）,并應盡可能縮短水樣在試驗前保存的時間。4.2.2 生產流程用水不穩(wěn)定的工業(yè)廢水，應在24h 之內，每隔6h 瞬時采樣一次，分別測定每個水樣，求得其最大毒性。4.2.3 廢水樣品可以用稀釋水稀釋配

7、成不同濃度的試驗液。5 . 試驗容器和儀器5.1 試驗容器可采用100 mL 小燒杯或結晶皿等玻璃制品，加蓋表面皿。為防止被玻璃器的吸附，試驗前可用低濃度試驗溶液浸泡一天。試驗結束后立即用空容器，刷洗、消除任何微量的溶液。5.2 量簡、容量瓶、移液管、吸管、玻璃缸、尼龍篩網等器皿5.3 溶解氧測定儀、pH計、溫度計、電導儀。6 環(huán)境條件6.1 試驗溫度要求基本穩(wěn)定，變化不超過±1 。試驗前的培養(yǎng)溫度要求與試驗溫度基本一致。毒性試驗在20± 1 或25± 1下進行。6.2 實驗在沒有對大型蚤有害的氣體、粉塵的大氣條件下進行。6.3 試驗在自然光照或相當于自然光照下進

8、行（ 避免陽光直射）每天光照10h 左右。6.4 大型蚤在試驗前應與試驗條件一致的環(huán)境中馴養(yǎng)710d。6.5 試驗操作及試驗過程中蚤類不能離開水，轉移時要用玻璃滴管。7 預試驗7.1 正式試驗之前，為確定試驗濃度范圍，必須先進行預備試驗。預備試驗濃度間距可寬一些 （如 0.1 、 1、 10） 每個濃度至少放5 個幼蚤，通過預試驗找出被測物使100大型蚤運動受抑制的濃度和最大耐受濃度的范圍，然后在此范圍內設計出正式試驗各組的濃度。7.2 預試驗中應了解毒物的穩(wěn)定性，在標準稀釋水中是否會出現沉淀、pH 等理化性質的改變。以便確定正式試驗是否需要采取流水或更換試驗液及改變稀釋水pH 等措施。8 正

9、式試驗8.1 試驗濃度的設計，根據預試驗的結果確定正式試驗的濃度范圍，按幾何級數的濃度系列（等比級數間距）設計57個濃度（如1、2、4、8、16等比級系數為2;又如1、1.8、3.2 、 5.6 、 10 等比級數系數為1.778） 。試驗濃度要設計合理，濃度系列中以能出現一個 60左右和40左右大型蚤運動受抑制或死亡的濃度最為理想。3.3 試驗用100mL燒杯（或結晶皿），裝4050mL試驗液，置蚤10個。每個濃度至少有 23個平行。一組試驗液設一空白對照， 內裝相等體積的稀釋水。 試驗前要用化學方法 測定試驗液的初始濃度。3.4 試驗開始后應于1、 2、 4、 8、 16及 24h 定期進

10、行觀察，記錄每個容器中仍能活動的水蚤數，測定0100%大型蚤不活動或死亡的濃度范圍，并記錄它們任何不正常的行為。在計算試驗蚤的不活動或死亡的百分數之后，立即測定試驗液的溶解氧濃度。3.5 檢查大型蚤的敏感性及試驗操作步驟的統(tǒng)一性，定期測定重鉻酸鉀的24h-EC50， 目的是驗證大型蚤的敏感性。在試驗報告中報告 24h-EC50。重銘酸鉀的24h-EC50為0.51.2ppm（20C 條件下）。按照第8章所敘述的步驟進行驗證檢查，如果重銘酸鉀的24h-EC50在0.51.2ppm以外，則應檢查使用試驗步驟是否嚴格，并檢查大型蚤的培養(yǎng)方式。如有必要，使用新的 符合敏感要求的大型蚤品種。9 數據結果

11、的處理及有效性9.1 EC50（LC50） 的估算試驗結束，計算每個濃度中不活動的大型蚤或死亡蚤占試驗總數的百分比，用概率單位目測法，計算EC50（或LC50）（見附錄C）。也可用計算機 EC50（或LC50）程序處理（寇氏修 正法），獲得EC50（或LC50）。9.2 結果的表示以 24h-EC50 或 48h-EC50 表示物質在相應時間內對大型蚤運動受抑制的影響。以24h-LC50 或 48h-EC50 表示物質在相應時間內對大型蚤生存的影響。當濃度間距過近仍不能獲得足夠數據時，可采用使100大型蚤活動受抑制或心臟停止跳動的最低濃度和使 0大型蚤活動受抑制或心臟停止跳動的最高濃度來表示毒

12、性影響的結果。檢測排水時，以百分數或毫升升表示。撿測化學物質時，以毫克升表示。9.3 試驗結果的有效性符合下列條件的試驗為結果有效。a. 對照組試驗未出現不活動大型蚤。b.重銘酸鉀的24h-EC50在20c時為8.51.2ppm的范圍內。c. 試驗結束時溶解氧濃度必須大于或等于2mg L。d.必須經檢測證明被測定的試驗物質濃度保持于試驗全過程（至少應為計劃配制濃度的80%）。如果濃度偏差20%,應以測試濃度結果為準。10試驗報告試驗報告要求包括以下幾個方面：a.實驗蚤的種名、來源、數目、蚤齡、餌料、馴養(yǎng)時間，對照組是否發(fā)生死亡。b.被測物質的化學性質、來源、樣品的保存方法、保存時間及前處理方法

13、。c.實驗用稀釋水的性質。d.試驗環(huán)境、水溫、pH、DO電導等情況。e.試驗條件下大型蚤的任何不正常行為，包括中毒癥狀。f.實驗結果、數據處理、結論、討論。g.方法依據及參考文獻。附錄A大型蚤的培養(yǎng)繁殖方法（補充件）A1試驗蚤的選育回原住試驗蚤（Daphnia magna）可以從其他試驗室已有的純培養(yǎng)中挑取、引種，也可以從野外 采集。野外采集的蚤要經分離、純化，在顯微鏡下鑒定后， 選擇體大、健康的母體數個,用50mL小燒杯單個培養(yǎng)。選擇繁殖量最大的一代為母蚤，單克隆化，使之成為純品系。A2餌料雌性的大型蚤可以在 20c生存4個月之久。蚤類喜食藻類、細菌、酵母及有機物碎屑等。 藻類的營養(yǎng)價值高于

14、其他食物，本方法推薦用實驗室培養(yǎng)的柵藻為大型蚤的餌料。柵藻 的培養(yǎng)方法見附錄BA3容器單個培養(yǎng)母蚤可用 50mL小燒杯，繁殖培養(yǎng)用 2000mL大燒杯，儲備培養(yǎng)用 30cmx 30cm 圓玻璃缸，或類似大小的水簇箱。A4喂養(yǎng)用不含無機培養(yǎng)劑的柵藻擴大培養(yǎng)液喂養(yǎng)大型蚤?？梢圆捎妹恐?次全部更換水蚤培養(yǎng)液的辦法，也可以每天追加一次濃縮懸浮藻液。培養(yǎng)液中柵藻的濃度不宜過高，一般在106個/L左右，藻液的顏色以淡蘋果綠色為宜。否則晚間缺氧會引起大型蚤的死亡。A5培養(yǎng)條件氯氣對大型蚤生存不利， 培養(yǎng)用水可選用經自然曝氣三天以上的自來水或人工配制的稀釋水，大型蚤生存的適宜溫度為17±25C,適宜

15、的pH為6.58.5。大型蚤的密度以每升水中培養(yǎng)50個左右母蚤為宜。過分擁擠，會造成大型蚤停止孤雌生殖。大型蚤對氧有較強的適應能力，培養(yǎng)液中可保持2mg7L以上的溶解氧。A6實驗蚤的分離大型蚤的生長是間歇性的、生長與脫殼交替進行。每脫殼一次，增加一齡，前后脫殼的時間叫齡期。性成熟前的齡期為幼齡蚤，性成熟后的為成齡蚤。大型蚤有46個幼齡期，幼齡蚤比成齡蚤對毒物更敏感。運動受抑制試驗一般選用實驗室條件下培養(yǎng)3代以上的、出生624h的幼蚤，最好為同一母體后代。采用下述方法可以獲得出生后624h的幼蚤。試驗前從實驗室儲備缸中挑取2030個懷卵母蚤，放在一個2000mL燒杯中單獨培養(yǎng)。18h后取走母蚤，

16、幼蚤仍在原繁殖缸中培 養(yǎng)，24h時，此繁殖缸中的幼蚤即為出生 624h的幼蚤。為保證大型蚤的良好繁殖，采用下述方法分離母蚤。用孔徑1000 dm尼龍網縫制成一個杯形的網袋(略小于繁殖缸)套在繁殖缸內壁，將母蚤放入網內，定期提出裝有母蚤的尼 龍網。放入另一個盛有斜生柵藻培養(yǎng)液的培養(yǎng)缸中。也可采用使繁殖缸的液體通過上、下套合在一起的兩個篩網的方法獲取試驗蚤。上層篩網的孔徑為 8001000 dm下層篩網的孔徑為4505000!母蚤被阻止在上層粗網上，幼蚤被阻止在下層細網上。用新鮮斜生柵藻擴大培養(yǎng)液，將濾得的水蚤分別沖入繁殖缸內。試驗期間每天分離一次，注 明幼蚤的出生日期，便得到出生不同時間的幼蚤。

17、定期淘汰老母蚤。附錄B斜生柵藻的培養(yǎng)技術(補充件)斜生柵藻具有較豐富的營養(yǎng)價值。實驗室實踐證明，用斜生柵藻喂養(yǎng)大型蚤，蚤的生長 快，個體大，繁殖量高。保持實驗室內斜生柵藻的良好生長是養(yǎng)好大型蚤的關鍵。B1培養(yǎng)基實驗室要經常保持一定數量的斜生柵藻藻種，可采用各種適用的培養(yǎng)劑，本方法推薦用水生4號培養(yǎng)劑。培養(yǎng)基成分(配1000mL)如下：硫酸俊(NH4)2SO 0.200g過磷酸鈣Ca(H 2PC4) 2 - HO-(CaSO4 H2O)飽和液 1mL硫酸鎂(MgSO - H2O) 0.080g碳酸氫鈉(NaHCO) 0.100g氯化鉀(KCL) 0.025g氯化鐵(FeCI 3)1 % ( “m

18、)0.15mL土壤浸出液0.500mLD2藻種的培養(yǎng)斜生柵藻可在搖床上振動培養(yǎng)，也可在流動通氣條件下連續(xù)培養(yǎng)，最簡單的培養(yǎng)方法是用1000mL三角瓶，裝 300400mL培養(yǎng)液，或者用 3000mL三角瓶裝1000mL培養(yǎng)液，接種藻種使成淡綠色。 瓶口加松軟棉團以防污染，溫度在1525C,光照在300040001x連續(xù)靜止培養(yǎng)。可采用 40W日光燈人工光照，燈源距離約2m也可用自然光照，避免陽光直射，日光照 610h。每天搖動56次，經幾天培養(yǎng)后藻液變?yōu)樯罹G色。培養(yǎng)好的藻液可做為擴大墻養(yǎng)用，也可經離心濃縮，或自然沉淀濃縮制成濃縮掖，貯于冰箱備用。藻種培養(yǎng)當中要經常鏡檢，檢查是否有雜藻、纖毛蟲和

19、輪蟲。藻種要經常轉接，以防止老化。轉接的時間視藻種生長的情況而定，一般每周12次，藻液發(fā)深綠色即要轉接。老化藻在顯微鏡下可明顯見到聚集成團的藻群、色素變黃，搖動振蕩后，仍出現大量沉 淀。D3斜生柵藻的擴大培養(yǎng)為獲得培養(yǎng)大型蚤的足夠餌料，可在實驗室內進行斜生柵藻的擴大培養(yǎng)。擴大培養(yǎng)采用30cmx 30cm的圓玻璃缸，或類似大小的水族箱。在玻璃缸中加入培養(yǎng)好的柵藻液(B2),用經自然曝氣的自來 水稀釋成淡綠色。擴大培養(yǎng)中不加任何營養(yǎng)鹽?？煞胖?1020條 斑馬魚(其他不食斜生柵簸的色也可 )，每天照舊投魚餌。魚可以起攪拌作用。其排泄物 也有利于柵藻的生長。擴大培養(yǎng)的柵藻液可直接喂大型蚤。附錄C 廢水或一種物質(儲備液濃度為1000mg/ L)對大型蚤(Daphnia magna)運動受抑制測定實例(補充件)C1預試驗結果(每個濃度5個大型蚤)(24h)表C1濃度，活動的大型蚤數目3.50100.3550.15正式試驗的濃度范圍為0.35 %1 %。C2正式試驗C2.1試驗結果24h的試驗結果如表 C2。表C2濃度24h活動的大型蚤個數不活動大型蚤百分濃度濃度對數值百分比概率值0（對照）3000.350.4525164.010.46-0.3318404.750.60 0.2210675.430.77 0.116805.841.002936.47C2.2 計算