初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證

1、初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)集團(tuán)標(biāo)準(zhǔn)化工作小組 #Q8QGGQT-GX8G08Q8-GNQGJ8-MHHGN#初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證方案產(chǎn)品名稱：一次性包皮環(huán)切縫合器編制：曰期審核：曰期批準(zhǔn)：曰期江西狼和醫(yī)療器械股份限有限公司目錄初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證方案2 .驗(yàn)證目的3 .職責(zé)與驗(yàn)證申請(qǐng)初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證方案1 .概述：初始污染菌的數(shù)量可以反映出車間環(huán)境衛(wèi)生的清潔度，與產(chǎn)品滅菌工藝、成品熱 原及內(nèi)毒素有直接關(guān)系，故而要對(duì)其檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)其有效性及檢測準(zhǔn)確 性，從而優(yōu)化產(chǎn)品滅菌工藝及控制產(chǎn)品熱原及內(nèi)毒素，確保產(chǎn)品的安全性。2 .目的：通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證檢測方法的適用性及計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基的適用性。3

2、.職責(zé)與驗(yàn)證申請(qǐng)：質(zhì)量管理部提供檢測項(xiàng)目方案、接收標(biāo)準(zhǔn)、評(píng)價(jià)等級(jí)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)。生產(chǎn)技術(shù)部負(fù)責(zé)按驗(yàn)證方案生產(chǎn)相關(guān)樣品初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證申請(qǐng)表驗(yàn)證組姓名職務(wù)單位黃麻-Xx 八、組長質(zhì)量管理部經(jīng)理江西狼和醫(yī)療器械股份有限公司龍章宏組員化驗(yàn)員蘇俊組員化驗(yàn)員胡梓鵬組員化驗(yàn)員批準(zhǔn)經(jīng)研究：同意以上成員組成驗(yàn)證小組，按照此方案對(duì)本公司的產(chǎn)品的初始污染菌實(shí)驗(yàn)方 法進(jìn)行驗(yàn)證。批準(zhǔn)人：年 月 日4 .依據(jù)：中國藥典2015版5 .驗(yàn)證計(jì)劃：實(shí)驗(yàn)操作人員確認(rèn)；實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)設(shè)備及器材的確認(rèn)；產(chǎn)品取樣及方法確認(rèn)。6 .驗(yàn)證內(nèi)容：菌種和菌液制備菌種試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0 代），

3、并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。菌液制備接種金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽抱桿菌的培養(yǎng)物至胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基 中或胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基上，3035C培養(yǎng)1824小時(shí)；接種白色念珠菌的培養(yǎng)物至沙 氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，2025c培養(yǎng)2-3天，上述培養(yǎng)后的 新鮮培養(yǎng)物用無菌化鈉-蛋白陳緩沖液或無菌化鈉溶液制成每1ml菌數(shù)小于lOOcfu （菌 落形成）的菌懸液。接種黑曲霉的培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂面培養(yǎng)基上，2025c培養(yǎng)57 天，加人35 ml %（ml/ml）聚山梨酯80的無菌化鈉-蛋白陳緩沖液或%無菌氯化鈉溶液， 將袍子洗脫。然后，采用

4、適宜的方法吸出袍子懸液至無菌試管內(nèi)，用 (ml/ml)聚山梨 醋80的無菌化鈉-蛋白陳緩沖液或%無菌氯化鈉溶液制成每1ml胞子數(shù)量小于lOOcfu的 胞子懸液。菌懸液若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在28 C在24h內(nèi)使用。黑曲 霉抱子懸液存在28C,在險(xiǎn)證過的貯存期內(nèi)用。計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查需氧菌的計(jì)數(shù)分別取1ml的金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽狗桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各 菌懸液，接種至胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基平板。金色葡萄球 菌、銅綠假胞菌、枯草芽胞桿菌在30-35C。，培養(yǎng)不超過3天；白色念珠菌、黑曲霉在 2O-25C0,培養(yǎng)不超過5天。每一試驗(yàn)菌株平行制

5、備2管或2個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)的 對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)分別取1ml的白色念珠菌、黑曲霉各菌懸液，接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。在 2O-25C0,培養(yǎng)不超過5天。每一試驗(yàn)菌株平行制備2管或2個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)的 對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。結(jié)果判定被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在范圍 內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培養(yǎng)基管 比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長良好。試驗(yàn)結(jié)果見表1計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證供試液的制備：洗脫液用益的滅菌生理鹽水，檢品液制備在10000級(jí)環(huán)境中進(jìn)行。接種和稀釋按下列要求進(jìn)行供試液的

6、接種和稀釋,制備微生物回收試驗(yàn)用供試液。所加菌液的 體積應(yīng)不超過供試液體積的1%。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最 低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。(1)試驗(yàn)組 取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每供試液或 每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfuo(2)供試品對(duì)照組取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。(3)菌液對(duì)照組取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液,按試驗(yàn)組操 作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o法選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方 法適用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用適宜的方法對(duì)供試液進(jìn)行進(jìn)一步的處理。如

7、果供試品對(duì)微生物 生長的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加 入試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適應(yīng)性試驗(yàn)?？咕钚缘娜コ驕缁罟┰囈航臃N后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。若試驗(yàn)組菌落數(shù) 減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值小于菌液對(duì)照組菌數(shù)值的50%,可采用下述方法消除供試 品的抑菌活性。(1)增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。(2)加入適宜的中和劑或滅活劑。微生物的回收按照的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基所用的試驗(yàn)菌逐一進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)，回收試驗(yàn)采用平皿法和 薄膜過濾法。取6個(gè)直徑90mm的無菌平皿。2個(gè)分別注入照上述”試驗(yàn)組.制備的供試液1ml ；2個(gè)分別注入照上述“供試品對(duì)照組”制備的供

8、試液1ml ； 2個(gè)分別注入照上述“菌液 對(duì)照組”制備的供試液51。每個(gè)平皿注入15 20ml溫度不超過45C。熔化的胰酪大豆陳 瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。薄膜過濾法薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于nm,直徑一般為50mm，若采用其他直徑的濾 膜,沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時(shí)應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的 充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過濾前 后的完整性。供試液經(jīng)薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量一般 為100ml。總沖洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損

9、傷。取照上述“試驗(yàn)組”、“供試品對(duì)照組”和“菌液對(duì)照組”制備的供試液適量 (一般取相當(dāng)于lg、1ml或10cm2的供試品，若供試品中所含的菌數(shù)較多時(shí)，供試液 可酌情減量)，加至適量的稀釋液中，混勻，過濾。用適量的沖洗液沖洗濾膜。每株試驗(yàn) 菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。若測定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基平板上；若測定 霉菌和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。薄膜過濾法計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)告報(bào)告編號(hào)： 報(bào)告時(shí)間:目錄初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)告1、目的2、概述3、測試方法與試驗(yàn)結(jié)果4、結(jié)論5、重新驗(yàn)證條件1 .目的：參照中

10、國藥典2015版，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證檢測方法的適用性及計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基的適用 性，從而驗(yàn)證現(xiàn)在使用初始污染菌實(shí)驗(yàn)方法是否準(zhǔn)確合格。2 .概述：產(chǎn)品型號(hào)為26型：批號(hào)為：3 .測試方法及檢驗(yàn)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)設(shè)備及器材：該實(shí)驗(yàn)使用儀器及器具主要有：滅菌移液管及移液槍吸嘴、無菌小泵管、培養(yǎng)皿、小型蠕動(dòng)泵、薄膜過濾器、滅菌鍋、白級(jí)工作臺(tái)、生物安全柜、電子天平、電熱恒溫培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱。設(shè)備名稱是否校量是否在有效期內(nèi)結(jié)論滅菌鍋已校量在有效期內(nèi)符合要求百級(jí)工作臺(tái)已校量在有效期內(nèi)符合要求生物安全柜已校量在有效期內(nèi)符合要求電子天平已校量在有效期內(nèi)符合要求電熱恒溫培養(yǎng)箱已校量在有效期內(nèi)符合要求霉菌培養(yǎng)箱已校量在有效期內(nèi)符合要

11、求確認(rèn)人/日期:審核/日期:使用材料及菌種：胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基、胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液 體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、胰酪大豆陳瓊脂培對(duì)照養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂對(duì)照 培養(yǎng)基、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌、白色念珠菌、黑曲霉（菌種 購買單位均為微生物種質(zhì)資源庫）。菌液制備:接種金色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌的培養(yǎng)物至胰酪大豆陳液體培養(yǎng) 基中或胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基上，3O35C培養(yǎng)1824小時(shí)；接種白色念珠菌的培養(yǎng)物至 沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，2025c培養(yǎng)2-3天，上述培養(yǎng)后 的新鮮培養(yǎng)物用無菌化鈉-蛋白陳緩沖液或無菌化鈉溶液制成每1

12、ml菌數(shù)小于 lOOcfu(菌落形成)的菌懸液。接種黑曲霉的培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂面培養(yǎng)基上， 2025c培養(yǎng)57天，加入35 ml %(ml/ml)聚山梨酯80的無菌化鈉-蛋白膝緩沖液或%無菌 氯化鈉溶液，將胞子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出胞子懸液至無菌試管內(nèi)，用% (rnl/rnl)聚山梨醋80的無菌化鈉-蛋白陳緩沖液或%無菌氯化鈉溶液制成每1ml胞子數(shù)量 小于lOOcfu的袍子懸液。菌懸液若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用；若保存在28 C在24h內(nèi)使用。黑曲 霉胞子懸液存在28C,在險(xiǎn)證過的貯存期內(nèi)用。培養(yǎng)基適用性檢查需氧菌的計(jì)數(shù)分別取1ml的金色葡萄球菌、銅綠假胞菌、枯草芽胞桿菌、白

13、色念珠菌、黑曲霉各 菌懸液，接種至胰酪大豆陳液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基平板。金色葡萄球 菌、銅綠假胞菌、枯草芽胞桿菌在30-35C。，培養(yǎng)不超過3天；白色念珠菌、黑曲霉在 2O-25C0,培養(yǎng)不超過5天。每一試驗(yàn)菌株平行制備2管或2個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)的 對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)分別取1ml的白色念珠菌、黑曲霉各菌懸液，接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。在 2O-25C0,培養(yǎng)不超過5天。每一試驗(yàn)菌株平行制備2管或2個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)的 對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。結(jié)果判定被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在范圍 內(nèi)，且

14、菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培養(yǎng)基管 比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長良好。試驗(yàn)結(jié)果見表1表1加入菌種- 養(yǎng)件 培條培養(yǎng)基菌落數(shù)cfu結(jié)論胰酪大豆陳瓊脂培 養(yǎng)基胰酪大豆陳瓊脂對(duì)照 培養(yǎng)基胰酪大豆陳瓊脂 培養(yǎng)基/胰酪大豆 陳瓊脂對(duì)照培養(yǎng) 基銅綠假單胞菌33c 48 小時(shí)菌落形 態(tài)大小于對(duì) 照培養(yǎng)基上 的菌落一致平均值金黃色葡萄球菌平均值枯草芽泡桿菌平均值白色念珠菌23。72 小時(shí)平均值黑曲霉平均值加入菌種培養(yǎng)條件培養(yǎng)基菌落數(shù)cfu沙氏葡萄糖瓊脂 培養(yǎng)基/沙氏葡萄 糖瓊脂對(duì)照培養(yǎng) 基結(jié)論沙氏葡萄糖瓊脂培 養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊脂對(duì)照 培養(yǎng)基白色念珠菌239,72 小時(shí)菌落形 態(tài)大小于

15、對(duì) 照培養(yǎng)基上 的菌落一致平均值黑曲霉平均值結(jié)論：從以上檢測結(jié)果可知，上述批號(hào)的培養(yǎng)基適用性檢查符合要求，可用于日常產(chǎn)品檢測中的計(jì)數(shù)。驗(yàn)證人/日期：審核/日期:計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證供試液的制備：洗脫液用吊的滅菌生理鹽水，檢品液制備在10000級(jí)環(huán)境中進(jìn)行。接種和稀釋按下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋,制備微生物回收試驗(yàn)用供試液。所加菌液的 體積應(yīng)不超過供試液體積的1乳為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最 低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。(1)試驗(yàn)組取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每1ml供試液或 每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfuo(2)供試品對(duì)照組取制備好

16、的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。(3)菌液對(duì)照組取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液,按試驗(yàn)組操 作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o法選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方 法適用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用適宜的方法對(duì)供試液進(jìn)行進(jìn)一步的處理。如果供試品對(duì)微生物 生長的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加 入試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適應(yīng)性試驗(yàn)?？咕钚缘娜コ驕缁罟┰囈航臃N后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。若試驗(yàn)組菌落數(shù) 減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值小于菌液對(duì)照組菌數(shù)值的50%,可采用下述方法消除供試 品的抑菌活性。

17、(1)增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。(2)加入適宜的中和劑或滅活劑。微生物的回收按照的計(jì)數(shù)培養(yǎng)基所用的試驗(yàn)菌逐一進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)，回收試驗(yàn)采用平皿法和 落膜過濾法。取6個(gè)直徑90mm的無菌平皿。2個(gè)分別注入照上述“試驗(yàn)組”制備的供試液1ml ；2個(gè)分別注入照上述“供試品對(duì)照組”制備的供試液1ml ； 2個(gè)分別注入照上述“菌液 對(duì)照組”制備的供試液51。每個(gè)平皿注入15 20ml溫度不超過45C。熔化的胰酪大豆陳 瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。表2一次性包皮環(huán)切縫合器 樣品1一次性包皮環(huán)切縫合器 樣品1一次性包皮環(huán)切縫合器 樣品1沖洗一次263025沖洗二次042沖洗三次000沖

18、洗四次000回收率100%平均回收率%修正系數(shù)結(jié)論：以上產(chǎn)品各做三套平均回收率達(dá)80%以上，一次回收率達(dá)到要求。正常試驗(yàn)中可 采用沖洗一次后*回收系數(shù)進(jìn)行估算。試驗(yàn)人/日期：審核/日期薄膜過濾法薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于pm,直徑一般為50mm，若采用其他直徑的濾 膜,沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時(shí)應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的 充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí)，應(yīng)保證濾膜在過濾前 后的完整性。供試液經(jīng)薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量一般 為100ml。總沖洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。取照上述“試驗(yàn)組”、“供試品對(duì)照組”和“菌液對(duì)照組”制備的供試液適量 (一般取相當(dāng)于lg、1ml或10cm2的供試品，若供試品中所含的菌數(shù)較多時(shí)，供