免疫熒光檢測(cè)Reg-與PML的定位

1、免疫熒光檢測(cè)Reg-與PML的定位為例1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?通過免疫熒光檢測(cè)Reg-與PML是否存在共定位2. 實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞內(nèi)的蛋白可通過特異性的抗體識(shí)別，帶有熒光基團(tuán)的二抗識(shí) 別一抗從而放大信號(hào)，用特定的激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)熒光基團(tuán)可觀察被檢蛋白在細(xì)胞 內(nèi)的定位或者表達(dá)情況。不同種屬來(lái)源的不同抗體可識(shí)別兩個(gè)(理論上可多個(gè)) 抗體，再用相應(yīng)的帶有不同熒光基團(tuán)的二抗去識(shí)別各自的一抗，可觀察到兩個(gè)蛋白之間的定位情況。3. 實(shí)驗(yàn)過程：(1) 各實(shí)驗(yàn)組取2000030000個(gè)細(xì)胞，用1640補(bǔ)齊各組的體積于100-200M， 1000rpm，5min甩片，用鉛筆標(biāo)記各處理組。(2) 稍晾干細(xì)胞，用阻水筆畫圈，圈

2、中滴滿預(yù)冷的4%的多聚甲醛，室溫固定10min(3) 預(yù)冷的PBS洗去多聚甲醛，將載玻片浸沒于甲醇中，室溫透化10min。(4) 預(yù)冷的PBS洗去甲醇，將載玻片放入濕盒中，2%的BSA室溫封閉2h。(5) 吸去BSA，加入配制于2%的BSA中的一抗，50T/片，放入濕盒，冷庫(kù)過夜 或者室溫2h。(6) 吸去一抗，PBS洗3次，每次5min(7) 加入配制于2%的BSA中的二抗，50叩片，放入濕盒，避光。室溫孵育 2h。(8) 吸去一抗，PBS洗3次，每次5min，注意避光。(9) 吸去PBS，DAPI室溫染色35min。(10) PBS吸去游離的DAPI，加入抗淬滅劑，10T/片，指甲油封片。

3、(11) 濕盒避光冷藏或者鏡檢。4. 實(shí)驗(yàn)實(shí)例及注意事項(xiàng)：(1) 整個(gè)過程中注意保持載玻片在一個(gè)潮濕的環(huán)境中，不能讓細(xì)胞區(qū)域太干燥。(2) 從加入熒光基團(tuán)開始應(yīng)注意避光，一抗如帶有熒光基團(tuán)應(yīng)從加入一抗后避光檢測(cè)活細(xì)胞狀態(tài)下標(biāo)記的熒光物質(zhì)應(yīng)從一開始進(jìn)行避光。（3）注意二抗的種屬來(lái)源，二抗之間不可有反應(yīng)，否則無(wú)法判斷二者之間的共定位。（4）不宜過長(zhǎng)時(shí)間冷場(chǎng)片子，做完后盡早鏡檢。（5）鏡檢時(shí)不宜長(zhǎng)時(shí)間對(duì)一塊區(qū)域長(zhǎng)時(shí)間激發(fā)。（6）共聚焦顯微鏡觀察時(shí)不一定要用指甲油封片（指甲油掉在共聚焦的鏡頭上老師 會(huì)不咼興），應(yīng)加入抗淬火劑后，改上蓋玻片后及時(shí)去拍片。（7）Reg-與PML的共定位5. 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑的配制：(1) 實(shí)驗(yàn)中的buffer為普通的PBS, PH7.4,實(shí)驗(yàn)前可在冰箱預(yù)冷。(2) 一抗配制時(shí)可根據(jù)看體的效價(jià)調(diào)整，一般是1:501:200,實(shí)驗(yàn)中的PML (Santa Cruz)、 Reg-V (華師大李曉濤)均為1: 100。二抗(國(guó)產(chǎn)，康陳生物， mouse-Rho, rabbit-Fitc),抗淬滅劑(Vector, Laboratories, Inc, CA), DAPI (Sigma),多聚甲醛(鼎 國(guó)),甲醇(國(guó)藥)。6. 附錄：(1) 用貼壁細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)，可在接種時(shí)放入滅菌的蓋玻片進(jìn)行爬片，處理結(jié)束后取出