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文檔簡介
1、免疫熒光檢測Reg-與PML的定位為例1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?通過免疫熒光檢測Reg-與PML是否存在共定位2. 實(shí)驗(yàn)原理:細(xì)胞內(nèi)的蛋白可通過特異性的抗體識(shí)別,帶有熒光基團(tuán)的二抗識(shí) 別一抗從而放大信號,用特定的激發(fā)波長激發(fā)熒光基團(tuán)可觀察被檢蛋白在細(xì)胞 內(nèi)的定位或者表達(dá)情況。不同種屬來源的不同抗體可識(shí)別兩個(gè)(理論上可多個(gè)) 抗體,再用相應(yīng)的帶有不同熒光基團(tuán)的二抗去識(shí)別各自的一抗,可觀察到兩個(gè)蛋白之間的定位情況。3. 實(shí)驗(yàn)過程:(1) 各實(shí)驗(yàn)組取2000030000個(gè)細(xì)胞,用1640補(bǔ)齊各組的體積于100-200M, 1000rpm,5min甩片,用鉛筆標(biāo)記各處理組。(2) 稍晾干細(xì)胞,用阻水筆畫圈,圈
2、中滴滿預(yù)冷的4%的多聚甲醛,室溫固定10min(3) 預(yù)冷的PBS洗去多聚甲醛,將載玻片浸沒于甲醇中,室溫透化10min。(4) 預(yù)冷的PBS洗去甲醇,將載玻片放入濕盒中,2%的BSA室溫封閉2h。(5) 吸去BSA,加入配制于2%的BSA中的一抗,50T/片,放入濕盒,冷庫過夜 或者室溫2h。(6) 吸去一抗,PBS洗3次,每次5min(7) 加入配制于2%的BSA中的二抗,50叩片,放入濕盒,避光。室溫孵育 2h。(8) 吸去一抗,PBS洗3次,每次5min,注意避光。(9) 吸去PBS,DAPI室溫染色35min。(10) PBS吸去游離的DAPI,加入抗淬滅劑,10T/片,指甲油封片。
3、(11) 濕盒避光冷藏或者鏡檢。4. 實(shí)驗(yàn)實(shí)例及注意事項(xiàng):(1) 整個(gè)過程中注意保持載玻片在一個(gè)潮濕的環(huán)境中,不能讓細(xì)胞區(qū)域太干燥。(2) 從加入熒光基團(tuán)開始應(yīng)注意避光,一抗如帶有熒光基團(tuán)應(yīng)從加入一抗后避光檢測活細(xì)胞狀態(tài)下標(biāo)記的熒光物質(zhì)應(yīng)從一開始進(jìn)行避光。(3)注意二抗的種屬來源,二抗之間不可有反應(yīng),否則無法判斷二者之間的共定位。(4)不宜過長時(shí)間冷場片子,做完后盡早鏡檢。(5)鏡檢時(shí)不宜長時(shí)間對一塊區(qū)域長時(shí)間激發(fā)。(6)共聚焦顯微鏡觀察時(shí)不一定要用指甲油封片(指甲油掉在共聚焦的鏡頭上老師 會(huì)不咼興),應(yīng)加入抗淬火劑后,改上蓋玻片后及時(shí)去拍片。(7)Reg-與PML的共定位5. 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑的配制:(1) 實(shí)驗(yàn)中的buffer為普通的PBS, PH7.4,實(shí)驗(yàn)前可在冰箱預(yù)冷。(2) 一抗配制時(shí)可根據(jù)看體的效價(jià)調(diào)整,一般是1:501:200,實(shí)驗(yàn)中的PML (Santa Cruz)、 Reg-V (華師大李曉濤)均為1: 100。二抗(國產(chǎn),康陳生物, mouse-Rho, rabbit-Fitc),抗淬滅劑(Vector, Laboratories, Inc, CA), DAPI (Sigma),多聚甲醛(鼎 國),甲醇(國藥)。6. 附錄:(1) 用貼壁細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí),可在接種時(shí)放入滅菌的蓋玻片進(jìn)行爬片,處理結(jié)束后取出
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