纖維蛋白(原)在大鼠胸主動脈球囊成形術(shù)后肌內(nèi)膜增殖中的作用

1、    纖維蛋白(原)在大鼠胸主動脈球囊成形術(shù) 后肌內(nèi)膜增殖中的作用        摘要目的：探討纖維蛋白(原)在大鼠胸主動脈球囊成形術(shù)后肌內(nèi)膜增殖中的可能作用。方法：用生化方法檢測術(shù)后血漿纖維蛋白原含量及用免疫組織化學(xué)方法。結(jié)果：纖維蛋白原含量在術(shù)后第1d組大鼠(3.85±0.30)g/L較假手術(shù)組大鼠(2.45±0.21)g/L明顯升高(P0.01)，第3 d組(6.08±0.68)g/L又較第1d組顯著升高(P0.01)，第7 d

2、組(5.37±1.05)g/L較第3d組無明顯下降(P0.05)，第14d組(3.86±1.09)g/L較第7d組已明顯下降(P0.01)，第21 d組(3.10±0.26)g/L較第14d組有所下降(P0.05)。免疫組化研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后10min，纖維蛋白(原)即在血管腔表面沉積，然后逐漸滲入增殖的內(nèi)膜中。術(shù)后早期降低血漿纖維蛋白原的水平，可抑制血管壁3HTdR的摻入術(shù)后7 d，(289±147比1588±180)counts·min-1/mg，P0.01；術(shù)后14d，(242±75比464±91)counts&#

3、183;min-1mg，P0.01)和肌內(nèi)膜的增殖(內(nèi)膜中膜面積，0.12±0.05 比 0.36±0.10，P0.01；內(nèi)膜中膜厚度，0.56±0.28 比 1.07±0.22，P0.01)。結(jié)論：纖維蛋白(原)參與了血管損傷后的平滑肌細(xì)胞增殖，降低血漿纖維蛋白原含量可抑制術(shù)后肌內(nèi)膜的增殖。主題詞內(nèi)皮，血管；纖維蛋白原；肌，平滑 The role of fibrinogen/fibrin in myointimal hyperplasia of rat's thoracic aorta by balloon angioplastyLIU Jin

4、g-Bo,WANG Li-Hui,TANG Chao-ShuFirst Affiliated Hospital,Beijing Medical University,Beijing(100034)AbstractAIM：To detect the role of fibrinogen/fibrin in myointimal hyperplasia of rat's thoracic aorta by balloon angioplasty and find the possible mechanism for restenosis.METHODS：A vascular intimal

5、 hyperplasia model was established by balloon angioplasty of rat's thoracic aorta.Plasma fibrinogen level was measured with biochemical method,and immunohistochemical method.RESULTS:Plasma fibrinogen level in the lst day group(3.85±0.30)g/L，was higher than fibrinogen level in sham group (2.

6、45±0.21)g/L, P0.01, the 3rd day group (6.08±0.68)g/L was significantly higher than the 1st day group(P0.01)，the 7th day group(5.37±1.05)g/L was lower than the 3rd day group nonsignificantly (P0.05),the 14 th day group(3.86±1.09)g/L was much lower than the 7th day group(P0.01)，and

7、 the 21st day group(3.10±0.26)g/L was also lower than the 14th day group(P0.05).At 10 min after operation,fibrinogen/fibrin deposition in luminal surface of injured aorta was observed,and then fibrinogenfibrin gradually infiltrated into neointima.The incorporation rate of3HTdR(the 7th day,(289&

8、#177;147 vs 588±180)counts*min-1/mg，respectively,P0.01；the 14th day (242±75 vs 464±91)counts*min-1/mg, respectively, P0.01, and myointimal hyperplasia(intima/media area,0.12±0.05 vs 0.36±0.10，P0.01；intima/media thickness,0.56±0.28 vs 1.07±0.22，respectively,P0.01)of

9、 injured vascular tissues were inhibited effectively by the defibrinated agent given at earlier stage after operation.CONCLUSION：Fibrinogenfibrin may play a role in myointimal hyperplasia of injured vascular wall after balloon angioplasty.MeSHEndothelium,vascular;Fibrinogen;Muscle,smooth纖維蛋白原(fibrin

10、ogen，F(xiàn)g)作為血液中的一種重要凝血因子，是冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生的一個重要的獨立的危險因素1。有報道經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)后血管再狹窄(restenosis,RS)的發(fā)生與血漿Fg的含量增多有重要關(guān)系，但其機理尚不清楚2。為此，本文在大鼠胸主動脈球囊損傷模型上觀察術(shù)后不同時期血漿和組織Fg含量的改變以及降低Fg對術(shù)后肌內(nèi)膜增生的影響，以探討Fg在血管損傷后肌內(nèi)膜增殖中的作用。材料與方法選用350400 g健康雄性Wistar大鼠行大鼠胸主動脈球囊成形術(shù)4。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%戊巴比妥鈉

11、(50 mg/kg,ip)麻醉動物后，將改良的2F Forgarty 球囊導(dǎo)管經(jīng)左頸總動脈插入至腹主動脈，然后注入0.1 mL生理鹽水使球囊充盈，反復(fù)抽拉3次后將血管結(jié)扎。術(shù)后大鼠分籠飼養(yǎng)，喂食普通飼料，自由飲水，經(jīng)Evans藍(lán)染色、光鏡和掃描電鏡證實胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞全部剝脫。1.血漿Fg的生化測定：將大鼠隨機分為正常組、假手術(shù)組和剝脫組(依術(shù)后處死時間不同又分為術(shù)后10 min、1、3、7、14和21 d組，每組均6只大鼠)。待大鼠麻醉后，經(jīng)腹主動脈穿刺取血，3.8%枸緣酸鈉抗凝并分離血漿。采用鹽析法測定血漿Fg含量5。2.血管壁Fg的免疫組織化學(xué)分析：將上述各組大鼠在處死前，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為

12、10%中性甲醛緩沖液原位灌注固定取材，經(jīng)固定、脫水、透明和石蠟包埋后，沿血管縱行切片，切片厚5 m，裱于用APES處理過的載玻片上。使用美國ZYMED公司生產(chǎn)的SPTM試劑盒進行Fg的免疫組織化學(xué)染色?？估w維蛋白原抗體購自Dako公司(稀釋度150)，陽性對照用PBS代替一抗。3.降低血漿Fg含量后的療效觀察：降低血漿Fg含量采用日本東菱藥品工業(yè)株式會社生產(chǎn)的東菱克栓酶。將大鼠隨機分為剝脫對照組和克栓酶治療組，每組11只。治療組大鼠術(shù)后即刻股靜脈推注東菱克栓酶(10 BU/kg)，術(shù)后48 h、96 h再按8 BUkg腹腔注射各1次。剝脫對照組以等量生理鹽水做對照。21 d后在上述動物左心室插

13、管，腹主動脈放血做原位灌注固定，石蠟包埋后切片做HE染色。用計算機像處理系統(tǒng)(西德產(chǎn)PCA×2）測定新生內(nèi)膜和中膜的面積和厚度比值。4.血管條3HTdR摻入測定6：將上述動物分為單純剝脫對照組和克栓酶治療組(用藥方法用上)，每組又依術(shù)后處死時間不同分為術(shù)后7 d和14 d組，各組均6只大鼠。放血處死大鼠后，迅速摘取胸主動脈約1.5 cm，在4生理鹽水中縱行切開后置入1.5mL RPMI 1640 培養(yǎng)液中，再加入1.5×3.7×104 Bq3HTdR，通以體積分?jǐn)?shù)為95% O2和體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的氣體，在37恒溫水浴振蕩孵育24 h。PBS沖洗3次后稱濕重，甲

14、酸消化，液閃儀(FJ210)測定放射強度。5.統(tǒng)計方法：所有結(jié)果均以x±s表示，組間差異用方差分析q檢驗。結(jié)果血漿Fg含量測定結(jié)果見表1。由表中可看出，術(shù)后10 min組大鼠血漿Fg水平較假手術(shù)組大鼠無明顯區(qū)別(P0.05)，術(shù)后1 d組大鼠明顯高于假手術(shù)組(P0.01)，術(shù)后3 d組又較術(shù)后1 d組高(P0.01)，術(shù)后7 d組雖略低于術(shù)后3 d組，但無顯著差異(P0.05)，術(shù)后14 d組則明顯低于術(shù)后7 d組(P0.01)，術(shù)后21 d組又稍低于術(shù)后14 d組大鼠(P0.05)。表1剝脫術(shù)后不同時間大鼠血漿的纖維蛋白原含量Tab 1Plasma fibrinogen conce

15、ntration in rats at different time after endothelial denudation(±s,g/L,n=6）GroupNormalSham10 min1 st day3 rd day7 th day14 th day21 st dayFibrinogen concentration2.52±0.182.45±0.202.65±0.123.85±0.306.08±0.685.37±1.053.86±1.093.10±0.26血管壁組織中Fg的免疫組化分析可見到術(shù)后1

16、0 min血管腔表面即有一層致密的Fg附著，之后，隨著新生內(nèi)膜的出現(xiàn)和增生，F(xiàn)g可逐漸滲入至增殖的內(nèi)膜中，術(shù)后21 d時，在增殖的新生內(nèi)膜中已可見到大量的Fg沉積。內(nèi)皮剝脫術(shù)后21 d時可見到明顯的新生內(nèi)膜形成，治療組大鼠血漿Fg水平降低后，其新生內(nèi)膜與中膜的面積和厚度比值均明顯低于單純剝脫對照組(P0.01)(見表2)。 表2血管內(nèi)膜與中膜的面積及厚度比值Tab 2The ratio of intima/media area and thickness (±s，n11)Group IntimaMedia areaIntimaMedia thicknessDenudation0.36

17、±0.101.07±0.22Treatment?0.12±0.06*0.68±0.28*P0.01，vs denudation內(nèi)皮剝脫后，損傷血管段的3HTdR摻入值明顯高于假手術(shù)組(P0.01)。治療組血漿Fg水平降低后，其血管段3HTdR摻入又顯著低于單純剝脫對照組(P0.01)(見表3)。 表3血管壁3HTdR摻入的結(jié)果Tab 3The result of the3HTdR incorporation of vascular wall (±s，n6,counts·min-1·mg-1）Group7 th day14 t

18、h daySham201±60217±47Denudation464±91*588±180*Treatment242±75289±147P0.01，vssham; P0.01, vs denudation 討論八十年代以來，隨著技術(shù)和方法的改進，PTCA這項治療冠心病的新技術(shù)以其療效高而在臨床上得到普及和開展。然而，PTCA術(shù)后PS的較高發(fā)生率嚴(yán)重阻礙了此項技術(shù)的應(yīng)用7。PS的發(fā)生機制目前并未完全闡明。眾多研究結(jié)果表明，其系以血管壁平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖為特征的病理過程，主要

19、表現(xiàn)為中層VSMC表型改變，并向內(nèi)膜遷移和增生，最后形成增厚的肌內(nèi)膜8。因此，抑制VSMC的增殖已成為防治PTCA術(shù)后RS發(fā)生的一個重要措施。Fg作為一種凝血因子，不僅是冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生的一個獨立的危險因子，還很可能是PTCA術(shù)后RS發(fā)生的重要危險因素，因為RS的發(fā)生類似于動脈粥樣硬化的快速發(fā)生9。本實驗表明，F(xiàn)g及其經(jīng)凝血酶作用后形成的纖維蛋白(fibrin,Fb)可破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell,EC)的結(jié)構(gòu)和功能，造成EC對某些大分子物質(zhì)的通透性增加，而且，F(xiàn)g(Fb)還可直接作用于VSMC，促進VSMC的遷移和增殖10。PTCA術(shù)后，血管局部的促凝物質(zhì)如凝血酶可

20、活化，而損傷的EC合成的一些抗凝成分如肝素樣糖胺聚糖可顯著減低，從而使血漿中的Fg易于附著在受損的血管表面而轉(zhuǎn)變?yōu)镕b，然后刺激VSMC的遷移和增殖。本實驗通過免疫組化方法發(fā)現(xiàn)在增殖的內(nèi)膜中有大量的Fg(Fb)沉積，更充分證明了這一點。因此，降低血漿Fg的含量，減低Fg在受損血管壁的沉積有可能減輕VSMC的增殖反應(yīng)。Fg作為一種急性期蛋白，在受到損傷刺激后可出現(xiàn)反應(yīng)性升高。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，球囊成形術(shù)后大鼠血漿Fg可急劇升高，且持續(xù)較長時間，這就更加劇了Fg(Fb)對損傷血管壁VSMC的增殖刺激作用。因此，應(yīng)在術(shù)后早期反復(fù)給藥降低反應(yīng)性升高的血漿Fg含量，才能達到抑制球囊成形術(shù)后肌內(nèi)膜增殖的作用

21、。東菱克栓酶可選擇性地作用于Fg A鏈N末端的精氨酸和甘氨酸之間，釋放纖維蛋白肽A，此時生成的纖維蛋白單體和纖維蛋白多聚體易分解從血液中排出，從而達到降低血漿Fg水平的目的。作者單位：劉京波汪麗蕙北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科(北京 100034)唐朝樞北京醫(yī)科大學(xué)心血管基礎(chǔ)研究所參考文獻1Ernst E.The role of fibrinogen as a cardiovascular risk factor.Atherosclerosis,1993,100:1.2Bini A,Fenoglio JJ,Mesa-Tejada R,et al.ldentification and distrib

22、ution of fibrinogen,fibrin and fibrin(ogen) degradation products in atherosclerosis.Arteriosclerosis,1989,9:109.3Montalescot G,Ankri A,Vicaut E,et al.Fibrinogen after coronary angioplasty as a risk factor for restenosis.Circulation,1995,92:31.4Haudenschild CC,Schwarta SM.Endothelial regeneration.ll.Restitution of endothelial continuity.Lab Invest,1979,41:407.5鄧家棟，楊崇禮，楊天楹，主編.血液病實驗室診斷.第1版.天津：天津科技出版社，1989，258259.6Mcmurry HF,Parrot DP,Dowyer ED.A standard method of culturing aortic explant,suitable for the study of factor