可溶性蛋白質(zhì)含量的測定

1、植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量的測定植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)含量是一個重要的生理生化指標， 如在研究每一種 酶的作用時常以比活(酶活力單位/毫克蛋白質(zhì)，unIT/Mg ProTeln)表示酶活力 大小及酶制劑純度，這就需要測定蛋白質(zhì)含量。常用的測定方法有 LoWry法和 考馬斯亮藍G-250染色法，本實驗將分別介紹這兩種方法。方法一：LoWry法(勞里法)【原理】LoWry法是雙縮脲法(BIureT)和福林酚法(F olln 酚)的結(jié)合與發(fā)展。其原理是蛋 白質(zhì)溶液用堿性銅溶液處理后，堿性銅試劑與蛋白質(zhì)中的肽鍵作用產(chǎn)生雙縮脲反 應，形成銅一蛋白質(zhì)的絡(luò)合鹽。再加入酚試劑后，在堿性條件下，這種被作用的 蛋白

2、質(zhì)上的酚類基團極不穩(wěn)定，很容易還原酚試劑中的磷鎢酸和磷鉬酸(PHosPHoMolyBdATe & PHosPHoTungsTATe)，使之生成磷鎢藍和磷鉬藍的混 合物。這種溶液藍色的深淺與蛋白的含量成正相關(guān)，所以可以用于蛋白質(zhì)含量的 測定。LoWry法除使肽鏈中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等顯色外，還使雙縮脲 法中肽鍵的顯色效果更強烈，其顯色效果比單獨使用酚試劑強 315倍，約是雙 縮脲法的100倍。由于肽鍵顯色效果增強，從而減少了因蛋白質(zhì)種類不同引起的 偏差。LoWry法適于微量蛋白的測定，對多個樣品同時測定較為方便。但對不 溶性蛋白和膜結(jié)合蛋白必須進行預處理(如加入少量的SDS)。1.

3、雙縮脲法的原理雙縮脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在堿性溶液中可與銅離子產(chǎn)生 紫紅色的絡(luò)合物，這一反應稱為雙縮脲反應。因為蛋白質(zhì)中有多個肽鍵，也能與 銅離子發(fā)生雙縮脲反應，且顏色深淺與蛋白質(zhì)的含量的關(guān)系在一定范圍內(nèi)符合比 爾定律，而與蛋白質(zhì)的氨基酸組成及分子量無關(guān)， 所以可用雙縮脲法測定蛋白質(zhì) 的含量。雙縮脲反應主要涉及肽鍵，因此受蛋白質(zhì)特異性影響較小。且使用試劑價廉易得， 操作簡便，可測定的范圍為110Mg蛋白質(zhì)，適于精度要求不太高的蛋白質(zhì)含 量的測定，能測出的蛋白質(zhì)含量須在約以上。雙縮脲法的缺點是靈敏度差、所需樣品量大。干擾此測定的物質(zhì)包括在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖液，如TrIs緩沖

4、液，因為它們產(chǎn)生陽性呈色反應，銅離子也容易被還原，有時出現(xiàn)紅色 沉淀。2.福林-酚法的原理 該方法是雙縮脲法的發(fā)展，包括兩步反應:(1) 在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì) 一銅絡(luò)合物。(2) 此絡(luò)合物將試劑磷鉬酸一磷鎢酸(F olln試劑)還原，混合物深藍色(磷鉬藍和磷 鎢藍混合物)，顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此方法操作簡便，靈敏度比雙縮 脲法高100倍，定量范圍為5100g蛋白質(zhì)。F olln試劑顯色反應由酪氨酸、 色氨酸、半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物，均有干 擾作用。此方法的缺點是有蛋白質(zhì)的特異性影響， 即不同蛋白質(zhì)因絡(luò)氨酸、色氨 酸含量的不同而使顯色強度

5、稍有不同，標準曲線也不是嚴格的直線形式?！緝x器與用具】試管若干；刻度移液管支，1MI 1支，10MI 1支；定量加樣器；圓底燒瓶；冷凝管1套(帶橡膠管);微量滴定管；小燒杯；微量進樣器50卩I 1支；721 分光光度計；恒溫水浴器；研缽；玻棒；離心機；離心管。【試劑】NA2WO4 2H2O; NA2MoO4 2H2O; 85%H3PO4;濃 HCI ； LI2SO4 H2O;溴水； 酚酞指示劑；NA2CO3 ; NAOH ; CuSO4 5H2O;酒石酸鉀鈉；牛血清白蛋白。 所用試劑均為化學純或分析純?！痉椒ā?試劑的配制(1) 堿性銅試劑(相當于雙縮脲試劑)的制備首先配制A液：4%碳酸鈉(N

6、A2CO3) 溶液與/ L氫氧化鈉(NAOH)溶液等比例混合(2% NA2CO3，NAOH); B液：1%硫酸銅(CuSO4 5H2O)溶液與2%酒石酸鉀鈉溶液等比例混合% CuSO4 5H2O, 0.1%酒石酸鉀鈉)。在使用前將A液與B液按50 : 1的比 例混合即成。此為F olIn 酚試劑甲液，此試劑只能使用1天。酚試劑(相當于F olIn試劑)的配備：稱取鎢酸鈉(NA2WO4 2H2O)1OOg、鉬酸鈉 (NA2MoO4 2H2O)25g，加蒸餾水700Ml溶解于1500Ml的圓底燒瓶中。之后加 入85%的H3PO45OMI，濃HCI 100Ml，安上回流裝置(使用磨口接頭，若用軟木

7、塞或橡皮塞時，就必須用錫鉑紙包起來)，使其慢慢沸騰10H。冷卻后加入硫酸 鋰(LI2SO4 H2O)150g，水50MI，溴水23滴，不用回流裝置開口煮沸 15Min， 以釋放出過量的溴。待冷卻后稀釋至 1000MI，并過濾入棕色瓶中，密閉于冰箱 中保存(冷卻后溶液呈黃色，倘若仍呈綠色，須再滴加數(shù)滴液體溴，繼續(xù)煮沸 15Min)。使用時用標準NAOH溶液滴定，以酚酞作為指示劑，滴定終點由藍變 灰，滴定后算出酸的濃度。使用時大約加水1倍，使最終濃度相當于1MoI/L H +酸，此為F olIn 酚試劑乙液(F olIn試劑)。在測定時要注意，因為酚試劑僅在酸性條件下穩(wěn)定，但此實驗的反應只在 PH

8、值 為10的情況下發(fā)生，所以當加酚試劑時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸 一磷鎢 酸試劑被破壞前即能發(fā)生還原反應，否則會使顯色程度減弱。(2) 標準蛋白質(zhì)溶液的配制稱取25mg牛血清白蛋白，溶于100MI蒸餾水中,使最終濃度為250 g/Ml。2標準曲線的繪制(1)取 7 支試管，編號后，分別加入 0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml標準蛋白質(zhì)溶液，用蒸餾水補足1Ml，使每管含蛋白量分別為0yg 2550100 yg 150200 yg 250 卩 g必要時可做重復)。(2) 在每支試管中用定量加樣器加入 5Ml甲液，混勻，于30°C下放置10M

9、in。(3) 在每支試管中噴射加入(I 5M1乙液，立即振蕩混勻，在30C下保溫30Min。準確到30Min后，以不加標準蛋白試管中的溶液為空白，在500nM下用1CM光徑的比色杯對系列標準蛋白溶液進行比色，測定光密度值。以蛋白濃度為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪制標準曲線。3樣品的測定(1) 樣品的提取：稱取鮮樣°旦，用5Ml蒸餾水或緩沖液研磨提取。取視蛋白質(zhì)含量適當稀釋)樣液加入試管中，然后重復步驟2的(2)g (3)g(4) ，以標準曲線中的0管為空白，測定吸光值。(2) 根據(jù)吸光值查標準曲線，求出比色液中的蛋白質(zhì)含量。4結(jié)果計算樣品中蛋白的含量(Mg/g)= CXVTV1X F

10、W 1000(2-1)式中C:查標準曲線值(y g)VT:提取液總體積(Ml);F W:樣品鮮重(g);V1:測定時加樣量(Ml)。【注意】 還原物質(zhì)，其他酚類物質(zhì)及檸檬酸對此反應有干擾方法二：考馬斯亮藍 G 250染色法【原理】考馬斯亮藍 G 250（GooMAssle BrIIIIAnT Blue G 250）測定蛋白質(zhì)含量屬于染 料結(jié)合法的一種。考馬斯亮藍 G 250在游離狀態(tài)下呈紅色，在稀酸溶液中，當 它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，前者最大光吸收?65nM,后者在595nM。 在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（1100卩g）蛋白質(zhì)與色素結(jié)合物在595nM波長下的光 吸收與蛋白質(zhì)含量成正比，

11、故可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G 250結(jié)合在2Min左右的時間內(nèi)達到平衡，完成反應十分迅速，其結(jié)合物在室 溫下1H內(nèi)保持穩(wěn)定。該反應快速靈敏（靈敏度比F olIn-酚法還高4倍）、易于操 作、干擾物質(zhì)少（考馬斯亮藍G 250和蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合，受蛋白質(zhì)的特 異性影響較小，除組蛋白外，其他不同種類蛋白質(zhì)染色強度差異不大），可測定微克級蛋白質(zhì)含量，是一種比較好的蛋白質(zhì)定量法。 但此方法也存在其缺點，考 馬斯亮藍在蛋白質(zhì)含量很高時線性關(guān)系偏低，且不同來源蛋白質(zhì)與色素結(jié)合狀況有差異?！緝x器與用具】721分光光度計；10Ml量筒1個；研缽；燒杯；量瓶；移液管：1MI 3支，01 M

12、l3支；10Ml具塞刻度試管14支?！驹噭繕藴实鞍踪|(zhì)溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白質(zhì)100upMl的標準蛋白溶液；90%乙醇；85% 磷酸（W/ V）；考馬斯亮藍G 250溶液：稱取100g考馬斯亮藍G 250,溶于50Ml 90 %乙醇 中，加入85%的磷酸100Ml，最后用蒸餾水定容到1000Ml，貯放在棕色瓶中， 此溶液在常溫下可放置1個月。【方法】標準曲線（蛋白質(zhì)含量為0100g/Ml）的繪制 取6支具塞試管，按表2 1 數(shù)據(jù)配制含0100g/Ml的牛血清蛋白質(zhì)液各1Ml。表21不同蛋白質(zhì)含量的牛血清蛋白質(zhì)液配制表管號123456蛋白質(zhì)標準液（ml）00.200.400.600.80

13、1.00蒸餾水（ml）1.000.800.600.400.200蛋白質(zhì)含量（yg 020406080100在每支試管中加入5Ml考馬斯亮藍G 250溶液，蓋塞，反轉(zhuǎn)混合數(shù)次，放置 2Min后，用1CM光 徑比色杯在595nM下比色。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，以吸光值為縱坐標繪制標 準曲線。2. 樣品提取液中蛋白質(zhì)濃度的測定吸取樣品提取液1.0MI（樣品提取見LoWry法），放入具塞試管中（每個樣品設(shè)置兩個重復），加入5MI考馬斯亮藍G 250溶 液，充分混合，放置2Min后在595nM下比色，記錄吸光值，并通過標準曲線查 得蛋白質(zhì)含量。3結(jié)果計算樣品中蛋白質(zhì)的含量（Mg/g）= CXVTV1X F

14、W< 1000 （2-2）式中 C:查標準曲線值（卩g）VT:提取液總體積（Ml）F W :樣品鮮重（g）;V1:測定時加樣量（Ml）。植物葉片可溶性蛋白含量測定注意點：1, 考馬斯亮藍G-250所配溶液不穩(wěn)定，所以每次實驗都必須新配，且必須 新做標準曲線；2, 考馬斯亮藍G-250配制完畢，如果發(fā)現(xiàn)溶液中有絮狀沉淀，可以試用濾紙過濾后使用，如果實驗中發(fā)現(xiàn)使用過濾后的考馬斯亮藍 G-250溶液在與樣品接 觸后短時間內(nèi)便又發(fā)生絮凝，基本上推測該考馬斯亮藍 G-250過期（比較容易出 現(xiàn)）。原理植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多數(shù)是參與各種代謝的酶類，測其含量是了解植物體總代謝的一個重要指標。在研究

15、每一種酶的作用時，常以比活（酶活力單位 / mg蛋白）表示酶活力大小及酶制劑純度。因此，測定植物體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì) 是研究酶活的一個重要項目。常用測定方法有Lowry法和考馬斯亮藍G-250染料 結(jié)合法?？捡R斯亮藍G-250測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種?？捡R斯亮藍 G-250在游離態(tài)下呈紅色，當它與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合后變?yōu)榍嗌罢咦畲蠊?吸收在465nm后者在595nm在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（0100卩g/ml ），蛋 白質(zhì)一色素結(jié)合物在595nm波長下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比。 故可用于蛋白 質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍G-250結(jié)合在2min左右的時間內(nèi)達到平衡， 完成反應十分

16、迅速，其結(jié)合物在室溫下 1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該反應非常靈敏，可測 微克級蛋白質(zhì)含量，所以是一種比較好的蛋白質(zhì)定量法。試劑(1) 牛血清白蛋白 配成100卩g/ml ;(2) 考馬斯亮藍G-250:稱取100mg考馬斯亮藍G-250溶于50ml 90% 乙醇中，加入85% (W/V磷酸100ml，最后用蒸餾水定容至1000ml。此溶液在 常溫下可放置一個月；(3) 90%醇；(4) 磷酸(85% W/V。方法1. 標準曲線的繪制(1) 0100卩g/ml標準曲線的制作取6支試管，按表28-1數(shù)據(jù)配制0100卩g/ml血清白蛋白液各1ml。準確吸取所配各管溶液0.1ml，分別放 入10ml具塞試管中，加入5ml考馬斯亮藍G-250試劑，蓋塞，反轉(zhuǎn)混合數(shù)次， 放置2min后，在595nm下比色，繪制標準曲線。表28-1 配制0100卩g/ml血清白蛋白液管號123456100卩g/ml牛血清蛋白量(ml)00.20.40.60.81.0蒸餾水量(ml)1.00.