生物樣本樣品前處理

1、2021/6/161生物樣品前處理生物樣品前處理范亞新2021/6/162簡介2021/6/163前處理技術(shù)1 1、直接稀釋法：、直接稀釋法：簡單、回收率高、成本低，但選擇性差，應(yīng)用有限簡單、回收率高、成本低，但選擇性差，應(yīng)用有限2 2、超濾法：、超濾法：多用于測定游離藥物濃度多用于測定游離藥物濃度3 3、蛋白沉淀法：、蛋白沉淀法：幾乎適用于所有小分子化合物，簡單快速，回收率高，幾乎適用于所有小分子化合物，簡單快速，回收率高，但選擇性差，基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重但選擇性差，基質(zhì)效應(yīng)嚴(yán)重4 4、液液提取法：、液液提取法：基質(zhì)效應(yīng)降低，低成本，重復(fù)性好；但難以自動化，基質(zhì)效應(yīng)降低，低成本，重復(fù)性好；但難以自動

2、化，不適用于水溶性化合物的提取，極性相差較大的化合物同時提取困難不適用于水溶性化合物的提取，極性相差較大的化合物同時提取困難5 5、固相萃取法：、固相萃取法：可實現(xiàn)自動化，基質(zhì)效應(yīng)降低，同時完成樣品的富集可實現(xiàn)自動化，基質(zhì)效應(yīng)降低，同時完成樣品的富集與凈化；但成本較高與凈化；但成本較高2021/6/164液液提取法 利用目標(biāo)化合物在生物基質(zhì)和與水不互溶的有機(jī)溶劑中溶解度或分配利用目標(biāo)化合物在生物基質(zhì)和與水不互溶的有機(jī)溶劑中溶解度或分配系數(shù)的不同，使化合物從生物基質(zhì)中轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中。系數(shù)的不同，使化合物從生物基質(zhì)中轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中。兩相的分離需借助兩相的密度差來實現(xiàn)兩相的分離需借助兩相的密度差來實

3、現(xiàn)原理：相似相溶原理：相似相溶分配系數(shù)：分配系數(shù)：k kA A=y=yA A/x/xA A y yA A和和x xA A分別表示在萃取相和萃余相中的質(zhì)量比率分別表示在萃取相和萃余相中的質(zhì)量比率選擇性系數(shù)（分離系數(shù)）：選擇性系數(shù)（分離系數(shù)）：=k=kA A/k/kB B= =萃取劑的選擇：萃取劑的選擇：1 1、選擇性好：表現(xiàn)為選擇性系數(shù)大。、選擇性好：表現(xiàn)為選擇性系數(shù)大。2 2、萃取容量大：表現(xiàn)為分配系數(shù)大。、萃取容量大：表現(xiàn)為分配系數(shù)大。3 3、萃取劑與原溶劑的互溶度。萃取劑與原溶劑的互溶度。4 4、萃取劑和原溶劑有較大的密度差。、萃取劑和原溶劑有較大的密度差。5 5、化學(xué)穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性耐

4、酸耐堿、抗氧化還原、耐熱、無腐蝕。耐酸耐堿、抗氧化還原、耐熱、無腐蝕。6 6、安全性好。、安全性好。7 7、經(jīng)濟(jì)性好。、經(jīng)濟(jì)性好。Tips: PHTips: PH和溫度對萃取有一定影響。和溫度對萃取有一定影響。BABAx/xy/y2021/6/165常用液液提取溶劑溶劑名稱溶劑名稱分子量分子量沸點（沸點（）密度（密度（g/mL)g/mL)偶極矩（偶極矩（D)D)二氯甲烷84.9401.331.60乙酸乙酯88.177.10.901.78氯代正丁烷92.6770.89乙醚74.134.50.711.15戊烷72.236.10.630 環(huán)己烷84.280.70.780正己烷86.2690.660.

5、08甲苯92.2110.60.870.36異丙醇*60.182.40.791.66四氫呋喃*72.1660.891.63乙腈*41.181.60.783.92正丁醇*74.11171.001.50水*18.01001.001.84注：注：“*”表示與水互溶表示與水互溶偶極矩越小，極性越小偶極矩越小，極性越小2021/6/166固相提取法HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance Copolymer)材料的優(yōu)點材料的優(yōu)點水可浸潤水可浸潤反相保留反相保留PH1-14PH1-14范圍內(nèi)穩(wěn)定范圍內(nèi)穩(wěn)定沒有裸露硅羥基沒有裸露硅羥基2021/6/167固相提取法2021/6/16

6、8固相提取法2021/6/169固相提取法改變化合物改變化合物PHPH，酸性，酸性保留，堿性洗脫保留，堿性洗脫2021/6/1610固相提取法改變化合物改變化合物PHPH，堿性，堿性保留，酸性洗脫保留，酸性洗脫2021/6/1611固相提取法改變吸附劑改變吸附劑PHPH，堿性，堿性保留，酸性洗脫保留，酸性洗脫2021/6/1612固相提取法改變吸附劑改變吸附劑PHPH，酸性，酸性保留，堿性洗脫保留，堿性洗脫2021/6/1613LC-MS-MS方法需考慮的問題基質(zhì)效應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)樣品中除被檢測化合物外的成分，對化合物測定造成影響的效應(yīng)。樣品中除被檢測化合物外的成分，對化合物測定造成影響的效應(yīng)。兩種

7、方式檢測基質(zhì)效應(yīng)：柱后灌流法（定性），樣品處理比較法（定量）。兩種方式檢測基質(zhì)效應(yīng)：柱后灌流法（定性），樣品處理比較法（定量）。解決方案：解決方案：1 1、改變樣品前處理方法。（液液提取和固相提取法可降低基質(zhì)效應(yīng)）、改變樣品前處理方法。（液液提取和固相提取法可降低基質(zhì)效應(yīng)）2 2、優(yōu)化色譜條件。（將干擾物和待測物分離）、優(yōu)化色譜條件。（將干擾物和待測物分離）3 3、優(yōu)化質(zhì)譜條件。（更換離子源，、優(yōu)化質(zhì)譜條件。（更換離子源，APCIAPCI源優(yōu)于源優(yōu)于ESIESI源）源）4 4、同位素內(nèi)標(biāo)。（終極辦法，最有效）、同位素內(nèi)標(biāo)。（終極辦法，最有效）生物基質(zhì)中的磷脂化合物易導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)，大多數(shù)表現(xiàn)為基

8、質(zhì)抑制。生物基質(zhì)中的磷脂化合物易導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)，大多數(shù)表現(xiàn)為基質(zhì)抑制。建議：建議：LC-MS-MSLC-MS-MS方法時監(jiān)測方法時監(jiān)測 m/zm/z184 184 m/zm/z184184離子對。離子對。2021/6/1614LC-MS-MS方法需考慮的問題非特異性吸附非特異性吸附在低蛋白含量的生物基質(zhì)（尿液，腦脊液，透析液等）中，化合物在存放在低蛋白含量的生物基質(zhì)（尿液，腦脊液，透析液等）中，化合物在存放/ /轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移過程中與容器材料發(fā)生特異性結(jié)合的現(xiàn)象。過程中與容器材料發(fā)生特異性結(jié)合的現(xiàn)象。在相應(yīng)的生物基質(zhì)中或水中測試，做轉(zhuǎn)管實驗。在相應(yīng)的生物基質(zhì)中或水中測試，做轉(zhuǎn)管實驗。通常更換儲存材料，或者在基質(zhì)中加入一定量表面活性劑可消除非特異性吸附現(xiàn)象。通常更換儲存材料，或者在基質(zhì)中加入一定量表面活性劑可消除非特異性吸附現(xiàn)象。 常見表面活性劑：常見表面活性劑：Triton-X-100Triton-X-100，吐溫等，吐溫等1、