蛋白質提取與制備的原理和方法

1、蛋白質提取與制備蛋白質種類很多，性質上的差異很大，既或是同類蛋白質，因選用材料不 同，使用方法差別也很大，且又處于不同的體系中，因此不可能有一個固左的程序適用各類蛋 白質的分離。但多數分離工作中的關鍵部分基本手段還是共同的，大部分蛋白質均可溶于水、 稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數與脂類結合的蛋白質溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機溶劑中。因 此可采用不同溶劑提取、分離及純化蛋白質和酶。蛋白質與酶在不同溶劑中溶解度的差異，主要取決于蛋白分子中非極性疏水基團與極性親水 基團的比例，其次取決于這些基團的排列和偶極矩。故分子結構性質是不同蛋白質溶解差異的 內因。溫度、pH、離子強度等是影響蛋白質溶解度的外界條件

2、。提取蛋白質時常根據這些內外 因素綜合加以利用。將細胞內蛋白質提取出來。并與英它不需要的物質分開。但動物材料中的 蛋白質有些可溶性的形式存在于體液（如血漿、消化硫等）中，可以不必經過提取直接進行分 離。蛋白質中的角蛋白、膠原及線蛋白等不溶性蛋白質，只需要適當的溶劑洗去可溶性的伴隨 物，如脂類、糖類以及英他可溶性蛋白質，最后剩下的就是不溶性蛋白質。這些蛋白質經細胞 破碎后，用水、稀鹽酸及緩沖液等適當溶劑，將蛋白質溶解出來，再用離心法除去不溶物，即 得粗提取液。水適用于白蛋白類蛋白質的抽提。如果抽提物的 pH 用適當緩沖液控制時，共穩(wěn)定 性及溶解度均能增加。如球蛋白類能溶于稀鹽溶液中，脂蛋白可用稀

3、的去垢劑溶液如十二烷基硫酸鈉、洋地黃皂昔（Digitonin）溶液或有機溶劑來抽提。英它不 溶于水的蛋白質通常用稀堿溶液抽提。蛋白質類別和溶解性質白蛋白和球蛋白：溶于水及稀鹽、稀酸、稀堿溶液，可被 50%飽和度硫酸彼析出。真球蛋白：一般在等電點時不溶于水，但加入少量的鹽、酸、堿則可溶解。擬球蛋白：溶于水，可為 50%飽和度硫酸彼析出醇溶蛋白：溶于7080%乙醇中，不溶于水及無水乙醇殼蛋白：在等電點不溶于水，也不溶于稀鹽酸，易溶于稀酸、稀堿溶液精蛋白：溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀組蛋白：溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀硬蛋白質：不溶于水、鹽、稀酸及稀堿綴合蛋白（包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白

4、、脂蛋白、血紅蛋白、金屬蛋白、黃素蛋白和氮苯蛋白等）：此類蛋白質溶解性質隨蛋白質與非蛋白質結合部分的不同而異，除脂蛋白外, 一般可溶于稀酸、稀堿及鹽溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，則脂溶性占優(yōu)勢，如脂肪部分 被包用于分子之中，則水溶性占優(yōu)勢。蛋白質的制備是一項十分細致的工作。涉及物理學、化學和生物學的知識很廣。近年來雖然有 了不改進，但英主要原理仍不外乎兩個方面: 一是利用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配于可用機械方法分離的兩個或幾個物相 中，如鹽析、有機溶劑提取、層析和結晶等: 二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于不同區(qū)域而達到分離的目 的，如電泳、超離心、超

5、濾等。由于蛋白質不能溶化，也不能蒸發(fā)，所能分配的物相只限于固 相和液相，并在這兩相間互相交替進行分離純化。制備方法可按照分子大小、形狀、帶電性質及溶解度等主要因素進行分類。按分子大小和形態(tài) 分為差速離心、超濾、分子篩及透析等方法：按溶解度分為鹽析、溶劑抽提、分配層析、逆流 分配及結晶等方法；按電荷差異分為電泳、電滲析、等電點沉淀、離子交換層析及吸附層析等: 按生物功能專一性有親合層析法等。由于不同生物大分子結構及理化性質不同，分離方法也不一樣。即同一類生物大分子由于 選用材料不同，使用方法差別也很大。因此很難有一個統(tǒng)一標準的方法對任何蛋白質均可循用。 因此實驗前應進行充分調查研究，查閱有關文獻

6、資料，對欲分離提純物質的物理、化學及生物 學性質先有一泄了解，然后再著手進行實驗工作。對于一個未知結構及性質的試樣進行創(chuàng)造性 的分離提純時，更需要經過各種方法比較和摸索， 才能找到一些工作規(guī)律和獲得預期結果。 其 次在分離提純工作前，常須建立相應的分析鑒左方法，以正確指導整個分離純化工作的順利進 行。高度提純某一生物大分子，一般要經過多種方法、步驟及不斷變換各種外界條件才能達到 目的。因此，整個實驗過程方法的優(yōu)劣，選擇條件效果的好壞，均須通過分析鑒泄來判明。3樓 物理方法主要通過各種物理因素的作用，使組織細胞破碎的方法。I反復凍融法于冷藏庫或干冰反復于零下 1520C使之凍固，然后緩慢地融解，

7、如此反 復操作，使大部分細胞及細胞內顆粒破壞。由于滲透壓的變化，使結合水凍結 產生組織的變性，冰片將細胞膜破碎，使蛋白質可溶化，成為粘稠的濃溶液， 但脂蛋白凍結變性。II冷熱變替法將材料投入沸水中，于 90C左右維持數分鐘，立即置于冰浴中使之迅速冷 卻，絕大部分細胞被破壞。II【超聲波法暴壺于 910千周聲波或 10500 千周超聲波所產生的機械振動，只要有設 備該法方便且效果也好，但一次處理量較小。應用超聲波處理時應注意避免溶 液中氣泡的存在。處理一些超聲波敏感的蛋白質酶時宜慎重。IV加壓破碎法加一泄氣壓或水圧也可使細胞破碎?；瘜W及生物化學方法I有機溶媒法粉碎后的新鮮材料在 0C 以下加入

8、510倍量的丙酮，迅速攪拌均勻，可破 碎細胞膜，破壞蛋白質與脂質的結合。蛋白質一般不變性，被脫脂和脫水成為 干燥粉末。用少疑乙瞇洗，經濾紙干燥，如脫氫酶等可保存數月不失去活性。 II自溶法將待破碎的鮮材料在一立 pH和適當的溫度下， 利用自身的蛋白酶將細胞破 壞，使細胞內含物釋放出來。比較穩(wěn)左，變性較難，蛋白質不被分解而可溶化。 利用該法可從胰臟制取竣肽酶。自體融解時需要時間，需加少疑甲苯、氯仿等。 應防止細菌污染。于溫室 30C 左右較早溶化。自體融解過程中 PH顯著變化，隨 時要調 pH.自溶溫度選在 04C,因自溶時間較長，不易控制，所以制備活 性蛋白質時較少用。III酶法與前述的自體融

9、法同理，用胰蛋白酶等蛋白酶除去變性蛋白質。但值得提 出的是溶菌酶處理時，它能水解構成枯草菌等菌體膜的多糖類。能溶解菌的酶 分布很廣。尤英卵白中含疑高，而多易結晶化。lg菌體加 110陀溶菌酶，p H6.27.Olh內完全溶菌。于生理食鹽水或 0. 2mol蔗糖溶液中溶菌，雖失去細 胞膜，但原形質沒有脫岀。除溶菌酶外，蝸牛酶及纖維素酶也常被選為破壞細 菌及植物細胞用。表面活性劑處理較常用的有十二烷基磺酸鈉、氯化十二烷基毗淀及去氧膽酸鈉等。此外一些細胞膜較脆弱的細胞，可把它們置于水或低滲緩沖劑中透析將細 胞脹破。2、細胞器的分離制備某一種生物大分子需要采用細胞中某一部分的材料，或者為了純化某 一特

10、左細胞器上的生物大分子，防止其他細胞組分的干擾，細胞破碎后常將細 胞內各組分先行分離，對于制備一些難度較大需求純度較高的生物大分子是有 利的。尤其近年來分子生物學、分子遺傳學、遺傳工程等學科和技術的發(fā)展， 對分布在各種細胞器上的核酸和蛋白質的研究工作日益增多，分離各種細胞器 上的各類核酸和特異性蛋白質已成為生物大分子制備工作重要內容之一。各類 生物大分子在細胞內的分布是不同的。DNA 幾乎全部集中在細胞核內。RNA 則大 部分分布于細胞質。各種酶在細胞內分布也有一立位宜。因此制備細胞器上的 生物大分子時，預先須對整個細胞結構和各類生物大分子在細胞內分布匹有所 了解。以肝細胞為例，蛋白質、酶及核

11、酸在肝細胞內分布情況為： 細胞核： 精蛋白、組蛋白、核酸合成酶系 RNA占總量 10喘左右 DA幾乎全部粒線體：電子傳遞、氯化磷酸化、三竣酸循環(huán)、脂肪酸氧化、氨基酸氧化、腮合成等酶系 RNA 占總量 5$左右 DNA 微量 內質網（微粒體）： 蛋白質合成酶系、疑化酶系 RNA占總量 50%左右溶酶體： 水解酶系（包括核酸酶、磷酸脂酶、組織蛋白酶及糖昔及糖昔酶等） 高爾基氏體：糖昔轉移酶、粘多糖及類固醇合成酶系細胞膜： 載體與受體蛋白、特異抗蛋、ATP 酶、環(huán)化腺昔酶、5 -核昔酸酶、 琥珀酸脫氫酶、匍萄糖-6-磷酸酶等，細胞液喀嚨和嚓吟代謝、氨基酸合成酶系、可溶 性蛋白類 RNA （主要為 t

12、RNA）占總30%.細胞器的分離一般采用差速離心法。 細胞經過破碎后， 在適當介質中進行差速 離心。利用細胞各組分質量大小不同，沉降于離心管內不同區(qū)域，分離后即得 所需組分。細胞器的分離制備、介質的選擇十分重要。最早使用的介質是生理 鹽水。因它容易使亞細胞顆粒發(fā)生聚集作用結成塊狀， 沉淀分離效果不理想， 現一般改用蔗糖、 Ficoll（種蔗糖多聚物）或匍萄糖-聚乙二醇等髙分子溶液。4 樓1.水溶液提取大部分蛋白質均溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中。因此蛋白質的提取一 般以水為主。稀鹽溶液和緩沖溶液對蛋白質穩(wěn)立性好、溶度大，也是提取蛋白 質的最常用溶劑。以鹽溶液及緩沖液提取蛋白質經常注意下面幾個因

13、素。 鹽濃度等滲鹽溶液尤以 0. 020. 05mol/L 磷酸鹽緩沖液和碳酸鹽緩沖液常用。0. 15mol/L 氯化鈉溶液應用也較多。如 6-磷酸葡萄糖脫氫酶用 0. lmol/L 碳酸氫鈉液 提取等。有時為了螯合某些金屬離子和解離酶分子與英他雜質的靜電結合，也 常使用枸椽酸鈉緩沖液和焦磷酸鈉緩沖液。有些蛋白質在低鹽濃度下濃度低， 如脫氧核糖核蛋白質需用 lmol/L以上氯化鈉液提取。總之，只要能溶解在水溶 液中而與細胞顆粒結合不太緊密的蛋白質和酶，細胞破碎后選擇適當的鹽濃度 及 PH,般是不難提取的。只有某些與細胞顆粒上的脂類物質結合較緊的，需 采用有機溶劑或加入表面活性劑處理等方法提取。

14、PH值蛋白質提取液的 PH值首先應保證在蛋白質穩(wěn)定的范圍內，即選擇在偏離等 電點兩側。如堿性蛋白質則選在偏酸一側，酸性蛋白質選擇偏堿一側，以增大 蛋白質的溶解度，提高提取效果。如細胞色素 C屬堿性蛋白質，常用稀酸提取, 肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質，用稀堿提取。某些蛋白質或酶與其分 物質結合常以離子鍵形式存在，選擇 PH36范圍對于分離提取是有利的。 溫度多數酶的提取溫度在 5C以下。少數對溫度耐受性較高的蛋白質和酶，可適 當提髙溫度，使雜蛋白變性分離且也有利于提取和進一步純化如胃蛋白酶等 及許多多肽激素類，選擇 3750C 條件下提取，效果比低溫提取更好。此外提取酶時加入底物或輔酶

15、， 改變酶分子表面電荷分布， 也能促進提取 效果。2. 有機溶劑提取有機溶劑提取用于提取蛋白質的實例至今是不多的。但一些和脂結合較牢或 分子中非極性側鏈較多的蛋白質，不溶于水、稀鹽或稀堿液中，可用不同比例 的有機溶劑提取。從一些粒線體（Mitochondria）及微粒體（Microsome）等含 多量脂質物質中提取蛋白質時，采用 Morton 的丁醇法效果較好。因丁醇使蛋白 質的變性較少，親脂性強，易透入細胞內部，與水也能溶解 10%,因此具有脂質 與水之間的表而活性作用，可占據蛋白質與脂質的結合點，也阻礙蛋白質與脂 質的再結合，使蛋白質在水中溶解能力大大增加。丁醇提取法的 pH及溫度選擇 范

16、用較廣（pH310,溫度-2至 40C）。國內用該法曾成功地提取了琥珀酸脫 氫酶。丁醇法對提取堿性磷酸脂酶效果也是十分顯著的。胰島素既能溶于稀酸、 稀堿又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以 60-70%的酸性乙醇提取效果最好，一 方而可抑制蛋白質水解酶對胰島素的破壞，同時也達到大量除去雜蛋白的目的。3. 表而活性劑的利用對于某些與脂質結合的蛋白質和酶，也有采用表而活性劑如膽酸鹽及十二 烷基磺酸鈉等處理。表而活性劑有陰離子型（如脂肪酸鹽、烷基苯磺酸鹽及膽酸鹽等），陽離子 型（如氧化節(jié)烷基二甲基彼等）及非離子型（Triton X-100、Tirton X-ll4. 吐溫 60及吐溫 80） 等。 非離

17、子型表而活性劑比離子型溫和， 不易引起酶失活, 使用較多。對于膜結構上的脂蛋白和結構，己廣泛采用膽酸鹽處理，兩者形成 復合物，并帶上凈電荷，由于電荷再排斥作用使膜破裂。近年來研究膜蛋白使 用表而活性劑的稀溶液提取時，較喜歡用非離子型表面活性劑。4.對提取物的保護在各種細胞中普遍存在著蛋白水解酶，提取時要注意防止由它引起的水解。前面所講的降低提取溫度英目的之一也是防止蛋白水解酶的水解。多數蛋白水 解酶的最適 PH在 35 或更高些，因在較低 PH條件下可降低蛋白質水解酶引起 的破壞程度。低 pH可使許多酶的酶原在提取過程中不致激活而保留在酶原狀 態(tài)，不表現水解活力。加蛋白質水解酶的抑制劑也同樣起

18、保護作用，如以絲氨 酸為活性中心的酶加二異丙基氟磷酸，以兢基為中心的酶加對氯汞苯甲酸等。 提取溶液中加有機溶劑時也能產生相類似的作用。蛋白水解酶的性質變化很大, 上述條件均視具體對象而變化。200S-3-26 16:21有一些蛋白含兢基，這些猛基可能是活性所必需。在提取這種蛋白不要帶 入金屬離子和氧化劑。 前者可往提取液中加金屬螯合劑如 EDTA,后者可加入還 原劑如抗壞血酸。有某些蛋白質帶一些非共價鍵結合的配基。提取時要注意保 護，不要使酸基丟失。蛋白質提取與制備的方法：1.分離純化的原則從破碎材料或細胞器提出的蛋白質是不純的，需進一步純化。純化包括將 蛋白質與非蛋白質分開，將各種不同的蛋白

19、質分開。選擇提取條件時，就要考 慮盡量除去非蛋白質。一般總是有其它物質伴隨混入提取液中。但有些雜質（如 脂肪）以事先除去為宜。先除去便于以后操作。常用有機溶劑提取除去。對于異類物質，提純蛋白質和酶時常混有核酸或多糖，一般可用專一性酶 水解，有機溶劑抽取及選擇性部分沉淀等方法處理。小分子物質常在整個制備 過程中通過多次液相與固相轉化中被分離或最后用透析法除去。而對同類物質 如酶與雜蛋白、RNA、DNA 以及不同結構的蛋白質、酶、核酸之間產分離，情況 則復雜得多。主要采用的方法有鹽析法、有機溶劑沉淀法，等電點沉淀法、吸 附法、結晶法、電泳法、超離心法及柱層析法等。英中鹽析法、等電點法及結 晶法用于

20、蛋白質和酶的提純較多，有機溶劑抽提和沉淀用于核提純較多，柱層 析法、梯度離心法對蛋白質和核酸的提純應用十分廣泛。如前所述，蛋白質的 分離純化較難，而且其本身的性質又限制了某些方法的使用，因此要研究目的 物的微細特征，巧妙的聯(lián)用備種方法并進行嚴密的操作，同時有必要了解精制 各過程的精制程度和回收率。具有活性的蛋白質可利用吸收光譜等物理性質或 以相當于單位氮活性增加為尺度進行追蹤。苴他蛋白質可用電泳、超離心、層 析、擴散及溶解等測定純度。如結晶核糖核酸酶經層析分為兩個成分?？梢妼?確定蛋白質結晶純度尚無最終的尺度。根據經驗即或純凈的標準品，有極微戢 的不純物時，也會給實驗帶來較大的影響。不穩(wěn)立的蛋

21、白質，如分離 SH-酶時 使用試劑及緩沖液等， 要確認不含重金屬離子 （特級試劑也需檢龍） 。蛋白質純 化的操作如脫鹽、濃縮干燥等均與低分子化合物不同，必須經過獨特的繁瑣操 作。蛋白質和蛋白質相互分離主要利用它們之間的并種性質的微小差別。諸如 分子形狀、分子量大小、電離性質、溶解度、生物功能專一性等。蛋白質提取 液中，除包含所需要的蛋白質（或酶）夕卜，還含有苴它蛋白質、多糖、脂類、 核酸及肽類等雜質。雜質除去的方法有：A. 核酸沉淀法該法可用核酸沉淀劑和氯化徭、硫酸魚精蛋白或鏈監(jiān)素等。必要時也可用 脫氧核糖核酸酶除去核酸。 即在粗勻漿中加入少量 DNase,于 4C 保溫 3060min,可使

22、DNA 降解為足夠小的碎片，以致不影響以后的純化。B. 醋酸鉛沉淀法利用醋酸鉛沉淀劑除去雜蛋白。 因這些沉淀劑也常常使需要的酶 （或蛋白質）緩緩變性而失去活性，所以用這類試劑時應迅速進行鹽析，使樣品與這類試劑 脫離接觸。C. 調 pH值或加熱沉淀法利用蛋白質酸堿變性性質的差異除去雜蛋白。利用蛋白質的熱變性的溫度 系數差異，可在一泄的 PH下將蛋白提取液加熱到一泄的溫度，使對熱不穩(wěn)左的 雜蛋白性沉淀而除去。D. 選擇性變性法利用各種蛋白質穩(wěn)左性的不同，可用選擇性變性法來除去雜蛋白。例如胰 蛋白爾及細胞色素 C等少數特別穩(wěn)左的酶，甚至可用 2.旅三氯醋酸處理，此時 其它雜蛋白均變性而沉淀，而胰蛋白

23、酶和細胞色素 C則仍留在溶液中。E. 透析法小分子物質常在整個制備過程中多次液相與固相互轉化中被分離，或最后 用透析法除去。F. 利用溶解度不同的純化方法2.鹽析法鹽析法對于許多非電解質的分離純化均適合。對蛋白質和酶的提純應用也 最早。至今還廣泛使用，一般粗抽提物經常利用鹽析法進行粗分。也有反復用 鹽析法得到純的蛋白質的例子。英原理是蛋白質在低鹽濃度下的溶解度隨鹽液 濃度升高而增加（鹽溶，與離子強度 101 間成比例增加）。球蛋白當鹽濃度不 斷上升時，蛋白質的溶解度又以不同程度下降并先后析出（鹽析）（離子強度 I210）。這是由于蛋白質分子內和分子間的電荷的極性基團有靜電引力。當水 中加入少量

24、鹽時，鹽離子與水分子對蛋白質分子一的極性基團的影響，使蛋白 質在水中溶解度增大。但鹽濃度增加一泄程度時，水的活度降低，蛋白質表而 的電荷大量被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質相互聚集而沉淀析出。鹽析法 是根據不同蛋白質在一左濃度鹽溶液中溶解度降低程度不同達到彼此分離的方 法。6樓 鹽的選擇如上所述，蛋白質在水中溶解度取決于蛋白質分子上離子基團周用的水分 子數目，即取決于蛋白質的水合程度。因此，控制水合程度，也就是控制蛋白 質的溶解度?？刂品椒ㄗ畛Ｓ玫氖羌尤胫行喳}。主要有硫酸彼、硫酸鎂、硫酸 鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。苴中應用最廣的是硫酸彼，它的優(yōu)點是溫度系數小而 溶解度大（25C時飽滿和溶解度為 4

25、.Imol,即 767g/l;0C 時飽滿和溶解度為 3.9 mol,即 676g/l） o 在這一溶解度范囤內，許多蛋白質均可鹽析岀來，且硫酸錢價 廉易得，分段效果較其它鹽好，不易引起蛋白質變性。應用硫酸彼時對蛋白氮 的測泄有干擾，另外緩沖能力較差，故有時也應用硫酸鈉，如鹽析免疫球蛋白， 用硫酸鈉的效果也不錯，硫酸鈉的缺點是 30C 以下溶解度太低。其它的中性鹽 如磷酸鈉的鹽析作用比硫酸彼好，但也由于溶解度太低，受溫度影響大，故應 用不廣。氯化鈉的溶解度不如硫酸彼，但在不同溫度下它的溶解度變化不大，這是方便之處。 它也是便宜不易純化的試劑。硫酸鞍濃溶液的 PH常在 4. 55. 5 之間，市

26、售的硫酸彼還常含有少量游離硫 酸,PH值往往降至 4. 5以下，當用英他 PH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節(jié).確定沉淀蛋白質所需硫酸彼濃度的方法將少量樣品冷卻到 05C,然后攪拌加入固體硫酸錢粉末，見蛋白質產生沉 淀時，禽心除去沉淀，分析上淸液確立所要蛋白質的濃度，如它仍在溶液中則 棄去沉淀，再加更多的硫酸彼于上淸液中，直到產生蛋白質沉淀時止。以所要 提取的蛋白質在溶液中的濃度對硫酸錢濃度作圖，得沉淀曲線，找出蛋白質開 始沉淀的濃度。如不考慮收率， 飽和度區(qū)間可取得窄一些， 使純度高一些。鹽析時注意的幾個問題：(1) 鹽的飽和度：不同蛋白質鹽析時要求鹽的飽和度不同。分離幾個混合組成 的蛋白質

27、時，鹽的飽和度常由稀到濃漸次增加。每出現一種蛋白質沉淀進行離 心或過濾分離后，再繼續(xù)增加鹽的飽和度，使第 2種蛋白質沉淀。例如用硫酸鞍 鹽析分離血漿中的蛋白質飽和度達 20 弔時，纖維蛋白原首先析岀：飽和增至 28 33%時，優(yōu)球蛋白析出；飽和度再增至 3350%時，擬球蛋白析出：飽和度大于 50%以上時淸蛋白析出。用硫酸彼不同飽和度分段鹽析法，可從牛胰酸性提取液 中分離得到 9 種以上蛋白質及酶。(2) PH值：pH值在等電點時蛋白質溶解度最小易沉淀析岀。因此鹽析時除個 別特殊情況外，pH 值常選擇在被分離的蛋白質等電點附近。由于硫酸披有弱酸 性，它的飽和溶液的 pH值低于 7,如所要蛋白質

28、遇酸易變性則應在適當緩沖液 中進行。(3) 蛋白質濃度：在相同鹽析條件下蛋白質濃度愈髙愈易沉淀。使用鹽的飽和 度的極限也愈低。如血淸球蛋白的濃度從 0.5%增至 3.0 弔時,需用中性鹽的飽和度 的最低極限從 29%遞減至 24%.某一蛋白質欲進行兩次鹽析時，第 1 次由于濃度較 稀，鹽析分段范國較寬，第 2次則逐漸變窄.例如膽堿酯酶用硫酸彼鹽析進時，第 1 次硫酸讓飽和度為 35%至 60%,第 2 次為 40%至 60$.蛋白質濃度髙些雖然對沉淀有 利，但濃度過高也易引起雜蛋白的共沉作用.因此，必須選擇適當濃度盡可能避 免共沉作用的干擾。(4) 溫度： 由于濃鹽液對蛋白質有一泄保護作用，鹽

29、析操作一般可在室溫下進 行。至于某些對熱特別敏感的酶，則宜維持低溫條件。通常蛋白質鹽析時對溫 度要求不太嚴格。但在中性鹽中結晶純化時，溫度影響則比較明顯。(5) 脫鹽： 蛋白質用鹽析法分離沉淀后，常需脫鹽才能獲得純品。脫鹽方法最 常用的是透析法。透析法所需時間較長，常在低溫下進行并加入防腐劑避免微 生物污染。透析使用前必須處理，方法是將透析袋巻于 0. 5mol/LEDTA 溶液中煮 0. 5h,棄去溶液,用蒸霜水洗凈，置 50%甘油中保存?zhèn)溆?。也可用分子篩層析， 常用 SephadexG-25柱層析法， 上樣不要超過床體積的 20%。此外，有些金屬離子能和蛋白質形成較為專一的結合而使蛋白質沉

30、淀。這 雖不是典型的鹽析，但在制備蛋白質中有許多成功的例子。鋅離子在特左 pH下 與胰島素結合形成沉淀就是這種例子。7樓 蛋白質從懸浮液中沉淀出來的速度極慢，必須用強力離心來促進這個過程。3.有機溶劑分離純化法有機溶劑能降低溶液的介電常數，從而增加蛋白質分子上不同電荷的引力, 導致溶解度降低。有機溶劑與水作用能破壞蛋白質的水化膜，使蛋白質在一定 濃度的有機溶劑中沉淀析出。常用的有機溶劑是乙醇和丙酮，由于有機溶劑的 加入易引起變性失活，尤其乙醇和水混合釋放熱呈:，操作一般宜在低溫下進行, 且在加入有機溶劑時注意攪拌均勻以免局部濃度過大。用此法所析出的沉淀一 般比鹽析法易過濾或離心沉降。分離后的蛋

31、白質沉淀應立即用水或緩沖液溶解, 以降低有機溶劑的濃度。操作時的 pH值大多數控制在待沉淀蛋白質等電點附 近。有機溶劑在中性鹽存在時能增加蛋白質的溶解度，減少變性和提高分離的 效果。一般在有機溶劑沉淀時添加中性鹽的濃度在 0. 05mol 左右,過多不僅耗費 有機溶劑，而且可能導致沉淀不好沉淀的條件一經確定，就必須嚴格控制，才能 得到重復性結果有機溶劑濃度通常以有機溶劑和水容積比或用百分濃度素示. 故操作條件比鹽析法嚴格。許多有機溶劑，如碳鏈較長的醇，它溶于水，但有限度。英量大到一左程 度后則分成兩相，一相以水為主，一相以有機溶劑為主。某些第 3組分的存在可 以改變兩相的比例和組成。有許多蛋白

32、質在兩相中均能溶解，形成分配。在同 一個兩相的溶劑系統(tǒng)中，不同的蛋白質有不同的分配系數。根據這一原理，操 作全部機械化的有逆流分溶。 因要求實驗室溫度恒眾且操作也繁雜， 雖一直有 人在用但很不普遍。分配層析也是應用這一原理，但在分離純化蛋白質工作中 用得不多，主要是因為多數蛋白質在有機溶劑中，特別是在易與水分相的溶劑 中溶解度小且易變性。4.疏水層析： 是近年發(fā)展的新方法。 它利用蛋白質表面有一部分疏水性，與帶有疏水性的載體在髙鹽濃度時結合。洗脫時將鹽濃度逐漸降低，蛋白質因 疏水性不同而逐個地先后被洗脫而純化。此法能分離英它一些方法不易純化的 蛋白質。利用分子形狀和大小不同的分離方法蛋白質形狀

33、有細長的如纖維，有密實的如圓球，形狀很不相同。蛋白質的 分子量從 6000左右開始，有各種大小，大的可以大到幾百萬。利用這些差別， 有幾種方法可用來分離蛋白質。5.凝膠層析屬最常用的蛋白質分離方法。系混合物隨流動相流經裝有凝膠作為固左相 的層析柱時，混合物中各物質因分子大小不同而被分離的技術。所指凝膠從廣 義上說是一類具有三維空間多孔網狀結構的物質，如天然物質中的馬鈴萼淀粉 及瓊脂糖凝膠，人工合成品的匍聚糖凝膠及帶離子交換基團的葡聚糖凝膠等。 把適當的凝膠顆粒裝填到玻璃管中制成層析柱，于柱內加入欲分離的混合物， 然后用大量蒸鐳水或其它稀溶液洗柱，由于混合物中各物質的分子大小和形狀 不同，在洗柱

34、過程中，分子量最大的物質不能進入凝膠網孔而沿凝膠顆粒間的 空隙最先流出柱外。分子量最小的物質因能進入凝膠網孔而受阻滯，流速緩慢, 致使最后流出柱外。整個過程和過濾相似，故又名凝膠過濾、凝膠滲透過濾、 分子篩過濾等。由于物質在分離過程中的阻滯減速現象，有人也稱之為阻滯擴 散層析、排阻層析等。凝膠過濾是分子篩的一種，在介紹凝膠過濾法之前，首先介紹分子篩的由 來。McBain(1928)提岀了分子篩的概念。后來發(fā)現這一現象在許多地方都存在。 Synge與 Tiselins (1950)在解釋凝膠層中的電泳和電滲現象時引用了分子篩 的概念。此后發(fā)現在柱層析中也有這種現象，于是許多工作者嘗試了一系列適

35、用于生物高分子分離純化用的分子篩。至 1959年 Porath與 Flodim 找到部分水 解的葡聚糖凝膠將其交聯(lián)，得到了商品爼為交聯(lián)匍聚糖(Sephadex)的分子篩。 該分子篩具有許多良好的性能，在蛋白質的分離分析中已被廣泛采用。Lathe -與 Ruthven(1956)曾利用分子篩效應測定過分子大小與分子量。Flo din與 Granath (1961)發(fā)現不同分子量的匍聚糖級分，其凝膠過濾行為與分子 量大小有關。Andrew (1962)發(fā)現蛋白質中也有類似的性質.此后經過不少人的 實際應用，完善了這一方法，形成一個可靠的測定髙分子分子量的方法。8 樓凝膠層析是 60年代初發(fā)展起來的

36、一種快速而又簡便的分離技術。由于設備 簡單、操作方便和不需要有機溶劑，以及對高分子物質有很高的分離效果，所 以目前它已被生物化學、分子生物學、生物工程學及醫(yī)藥學等有關領域廣泛應 用。A. PH 值與沉淀蛋白質或酶原理相同，結晶的溶液 PH值一般選擇在被結晶的蛋白質 或酶的等電點附近，以利于晶體的析出。B. 溫度除少數情況外，通常選擇低溫條件進行。低溫條件對蛋白質和酶不僅溶解 度低且不易變性。在中性鹽溶液中結晶時，溫度可在 oc至室溫范國內選擇，在 有機溶劑中結晶一般要求溫度較低。C. 晶種不易結晶蛋白質和酶如糜蛋白酶，往往加入微量的糜蛋白酶結晶可導致大 量結晶的形成。有時用玻璃輕輕摩擦容器壁也

37、可達到此目的。需加晶種才能形 成結晶的蛋白質或酶，大多數結晶收率都不高。D. 金屬離子有些蛋白質和酶結晶時還需加入金屬離子，如鐵蛋白在硫酸彼溶液中結晶 時，加入少量鎘離子才形成菱狀結晶，烯醇化酶也常加入汞鹽后形成結晶。E. 結晶時間在結晶條件比較適合的情況下，在幾小時甚至幾分爼即可獲得結晶。但有 些情況需數天甚至數月才能結晶完全，視齊種蛋白質和酶的具體情況不同而龍。 蛋白質和酶的結晶大多數是針狀、棒狀、片狀，有的為八而體或立方體的菱狀 結晶。結晶的大小與結晶時間及條件有關。6.蛋白質的干燥干燥是將潮濕的固體、半固體或濃縮液中的水分(或溶劑)蒸發(fā)除去的過 程。根據水分在固體中分布情況可分為表而水

38、分、 毛細管水分和被膜所包國的 水分 3種。表而水分附著于固體表而，蒸發(fā)時完全址露于外界空氣中，干燥最快、 最均勻。毛細管水分存在于固體極細孔隙的毛細管中，水分子逸出比較困難， 蒸發(fā)時慢并需較髙溫度。膜包 I刑的水分如細胞中被細胞質膜所包附的水分，需 經緩慢擴散至膜外才能蒸發(fā)最難除去。被干燥的物質貝濕度與周圍空氣的濕度 是一個動態(tài)平衡關系，暴壺于大氣中的物質是不會絕對干燥的。若使被干燥的 物質所含水分低于周羽空氣中水分，則必須放在嚴密封蓋的容器中進行干燥。 用這種方法可得到含水雖極低的干燥樣品，生物大分子制備得到所需的產品后, 為了防止變質易于保存和運輸，常需要干燥處理，最常用的方法是冷凍干燥

39、和 真空燥，某些無活性核酸、微生物酶制劑和酪蛋白等工業(yè)產品則較多地應用 噴霧干燥、氣流干燥等直接干燥法。(1) 真空干燥在相同溫度下，被干燥物質所含水分或溶劑由于周用空氣壓力的降低蒸發(fā) 速度增加。真空度愈高，溶劑沸點愈低，蒸發(fā)愈快。英原理與真空濃縮(或稱 減壓濃縮)相同。真空干燥適用于不耐髙溫、易氧化物質的 F 燥和保存，整個 裝置包括下燥器、冷凝器、及貞空泵 3 部分。干燥器頂部連接一帶活塞的管道接 通冷凝器，氣化后的蒸氣由此管道通過冷凝管凝聚，冷凝器另一端連接真空泵, 干燥器內常放一些干燥劑如五氧化二磷、無水氯化鈣等，以便干燥保存樣品。(2) 冷凍真空干燥冷凍真空干燥除利用真空干燥原理外，

40、同時增加了溫度因素。在相同的壓 力下，水蒸氣壓隨溫度的下降而下降。在低溫下低壓下冰很容易升華為氣體。 操作時通常將等干燥的液體冷凍到冰點以下使之變成固體，然后在低溫低壓下 將溶劑變成氣體而除去。干燥后的產品具有疏松、溶解度好、保持天然結構等 優(yōu)點，適用于務類生物大分子的干燥保存。樣品干燥時先在培養(yǎng)皿內鋪成薄層(厚度不超過 lcm的液體)，置于低溫冰箱內凍固。另在真空干燥器內用兩個培養(yǎng)皿分別放置固體氫氧化鈉和五氧化二磷，貞 空干燥上端抽氣通過五氧化二磷干燥管與真空泵相連。當放進等待干燥的凍塊后，立即封閉干燥器，開動真空泵，纟 1：510h 后得冷凍干燥品。也可將待干燥物質置于圓底容器中，然后浸入

41、干冰-乙醇混合而成的冷卻劑中，容器內液體迅速凍成固體，抽真空后等干燥凍塊的水分子升華變成氣體，經過冷凝器凝結為霜。冰凍的樣品逐漸失去水分變成疏松的干燥粉末。上述操作關鍵在于真空泵的髙真空度及管道的口徑要合適。9 樓(3)噴霧干燥噴霧干燥是將液體通過噴灑裝置噴成霧滴后，與干燥介質(通常為熱空氣) 直接接觸干燥的方法。由于液體分散為霧滴時，直徑通常只有 1200 um大小, 與熱空氣接觸而大， 水分蒸發(fā)很快。 在 100C的熱空氣中只需不到 1 秒的時間即 可干燥。因 T燥時間短和水分蒸發(fā)時吸收熱疑，使液滴及其附近的空氣溫度較 低，故工業(yè)上常用。7.樣品貯藏保存保存方法和生物大分子穩(wěn)泄性有很大關系，生物大分子的貯藏保存可分為 干態(tài)和液態(tài)貯藏兩種。但不論是干態(tài)或液態(tài)貯藏均應避免長期眾壺于空氣中防 止微生物的污染。溫度對生物大分子的穩(wěn)左性影響很大，低溫保存在大多數情 況下是有利的。(1) 干態(tài)貯藏干燥的制品一般比較穩(wěn)定，如制品含水量很低，要低溫情況下物質大分子 活性可在數月甚至數年無顯著變化。貯藏方法也很簡單，只將干燥后的樣品置 于干燥容器內(內裝有干燥劑)密封，保存于 04C 冰箱中即可。有時為了取 樣方便和避免取樣時樣品吸水和污染，可先將樣品分裝于許多小瓶中，每次用 時只取岀 1 瓶。(2) 液態(tài)貯藏液態(tài)貯藏的優(yōu)點是使樣品免去干燥這一步驟，生物大分