氨甲酰妥布霉素高產(chǎn)菌株選育及其發(fā)酵特性研究

1、氨甲酰妥布霉素高產(chǎn)菌株選育及其發(fā)酵特性研究 作者：林玉雙 洪文榮 林燁 梁枝定【摘要】 目的 篩選氨甲酰妥布霉素高產(chǎn)菌株并穩(wěn)定其發(fā)酵效價。方法 以黑暗鏈霉菌Ts?228為出發(fā)菌株，經(jīng)自然分離，UV誘變結(jié)合耐自身代謝產(chǎn)物處理，采用瓊脂塊法并結(jié)合搖瓶發(fā)酵來篩選高產(chǎn)菌，獲得了Tt?49新菌株。以搖瓶發(fā)酵考察生長特性，罐上發(fā)酵繪制代謝曲線。結(jié)果 效價提高了1.8倍，妥布霉素含量高達(dá)68.5%。該菌株生長周期僅4d，傳代穩(wěn)定。論文學(xué)術(shù)科研網(wǎng)種齡18h左右，接種量10%。按照代謝曲線圖進(jìn)行調(diào)控，發(fā)酵罐的產(chǎn)抗水平達(dá)5865u/ml。結(jié)論 自然分離與誘變相結(jié)合，是黑暗鏈霉菌選育的有效途徑。出發(fā)菌株經(jīng)UV誘變和

2、耐受馴育，發(fā)酵效價顯著提高。溶氧是妥布霉素發(fā)酵生產(chǎn)中的重要調(diào)控因子。 【關(guān)鍵詞】 黑暗鏈霉菌； 氨甲酰妥布霉素； 深層發(fā)酵； 抗生素 ABSTRACT Objective Screening a high and stable mutant strain from S.tenebrarius Ts?228 for CTB (carbamoyltobramycin) production. Methods A parent strain (Ts?228) was isolated by natural selection, then treated by UV, and cultured on

3、plate containing tobramycin. Finally, a high yield mutant Tt?49 was obtained through several cyclic screening. Its productivity was detected in flask and the curves of typical fermentation were processed in 50L fermenter. Results A mutant strain Tt?49 was cultured. Its fermentation titre increased t

4、o 5869u/ml which was 1.8 times higher than the parent strain Ts?228, and the component ratio of tobramycin comes up to 68.5%. The fermentation course of Tt?49 only need 4 days. The 18h?seed mycelium and 10% W/V of inoculation were used. Conclusions The combination of natural selection and UV was a u

5、seful method for tobramycin from S.tenebrarius. Dissolved oxygen is an important parameter in fermentation condition. KEY WORDS S.tenebrarius; Tobramycin; Fermentation; Antibiotics 氨甲酰妥布霉素(carbamoyltobramycin)是黑暗鏈霉菌(Streptomyces tenebrarius)經(jīng)深層發(fā)酵產(chǎn)生的尼拉霉素復(fù)合物5組分，經(jīng)酸或堿催化水解得到妥布霉素(tobramycin)。妥布霉素是臨床上廣泛使用的

6、第二代氨基糖苷類抗生素，主要作用于細(xì)菌30S核糖體亞基，抑制菌體蛋白質(zhì)的合成，廣泛應(yīng)用于敗血癥、中樞神經(jīng)感染及新生兒的膿毒癥等1，總有效率達(dá)85%以上。妥布霉素與其它抗生素聯(lián)合使用，不僅可增強抗菌活性，還可擴大抗菌范圍。此外，妥布霉素對第八對腦神經(jīng)的耳毒性比新霉素、慶大霉素低。由于發(fā)酵效價不穩(wěn)定，分離純化困難，生產(chǎn)成本居高不下，銷售價格昂貴，影響其普及使用。 有關(guān)妥布霉素的研究活動一直很活躍，從生產(chǎn)菌株的改良到代謝途徑的揭示，再到合成基因簇的克隆等各方面均有。沈陽藥科大學(xué)采用紫外線和亞硝基胍結(jié)合耐受處理篩選妥布霉素產(chǎn)生菌2，3；丹麥科研人員利用碳標(biāo)記實驗考查代謝產(chǎn)物的通量，發(fā)現(xiàn)黑暗鏈霉菌在生長

7、階段ED途徑活躍4，但未闡明安普霉素、卡那霉素B和妥布霉素的分歧代謝途徑；韓國研究者于2004年從黑暗鏈霉菌ATCC17920中分離到妥布霉素生物合成基因簇5，有望給妥布霉素的生產(chǎn)帶來質(zhì)的飛躍，但闡明各個基因的功能并將其運用于工業(yè)化生產(chǎn)仍需一段過程。本文從菌種選育和工藝優(yōu)化兩方面進(jìn)行研究，穩(wěn)定并提高了妥布霉素工業(yè)化生產(chǎn)，取得了實效。 1 材料與方法 1.1 實驗材料 菌種 黑暗鏈霉菌(Streptomyces tenebrarius)Ts?228；枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)CMCC(B)63501，本實驗室保藏菌。 培養(yǎng)基(%) 斜面：葡萄糖3.0，蛋白胨0.5，氯化鉀

8、0.05，F(xiàn)eSO4?7H2O 0.001，磷酸氫二鉀0.10，硫酸鎂0.05，瓊脂2.0，pH自然；種子：葡萄糖0.5，玉米淀粉1.0，黃豆餅粉1.5，硫酸鎂0.5，磷酸二氫鉀0.05，氯化鉀0.1，CaCl2 0.025，pH自然；發(fā)酵：葡萄糖1.5，玉米粉2.0，黃豆餅粉3.5，硫酸銨0.7，硫酸鎂1.1，碳酸鈣0.7，硫酸鋅0.01，玉米淀粉2.0，豆油1.0，pH7.07.2。 儀器 生化培養(yǎng)箱(LRH?250A)；220r/min搖瓶機(自制)；15L種子罐和50L發(fā)酵罐(上海國強生化工程裝備有限公司)；臺式離心機(TGL16G)。 妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)品和生測培養(yǎng)基：中國生物制品檢定所。

9、 1.2 分析方法 發(fā)酵效價采用生物檢定法6；組分檢測用薄板層析6和HPLC法7。菌絲濃度測定，取發(fā)酵液10ml，3000r/min離心10min，去上清液后的固體物作為相對菌絲濃度。其它項目(總糖、還原糖、氨基氮等)均采用工業(yè)化常規(guī)分析法8。 2 結(jié)果與討論 2.1 自然分離 出發(fā)菌株黑暗鏈霉菌Ts?228主產(chǎn)尼拉霉素2，4和5三個組分，菌落較大，孢子乳白，生測效價為3260u/ml。該菌株的單孢子懸液經(jīng)自然分離獲得白色和淡黃色兩類菌落，瓊脂塊法檢測菌落的抑菌效果。結(jié)果顯示白色菌落抑菌活性高于淡黃色菌落，具備較好的生產(chǎn)潛力；淡黃色菌落在多次測定中抑菌活性均較低，參照文獻(xiàn)9認(rèn)為該菌落形態(tài)為退化

10、株，不宜做出發(fā)菌。對白色菌落進(jìn)行多次分離純化，獲得一比出發(fā)菌株提高8.27%，編號為Tn?17的高產(chǎn)菌株。 2.2 紫外誘變處理 取Tn?17菌株，制作單孢子懸液，分別在30W紫外燈下照射10、30、50、70和90s，然后分離單菌落，進(jìn)行瓊脂塊初篩，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，結(jié)果見表1。 由表1可見，經(jīng)紫外照射效價均有所提高。隨著照射劑量的增加，死亡率漸次升高，正變率降低，負(fù)變率升高。其中50s為最宜劑量，致死率為85.1%，正變率為3.74%，負(fù)變率為15.1%，最高增幅為12.1%，此高產(chǎn)菌株編號為Tv?204。 表1 Tn?17紫外線照射時間與突變率的關(guān)系 2.3 耐自身代謝產(chǎn)物的分離篩選 依據(jù)高

11、效價具有高抗性，高抗性不等于高效價的原則，利用抗自身代謝產(chǎn)物對抗生素產(chǎn)生菌進(jìn)行選育是提高抗生素產(chǎn)量的有效手段。在培養(yǎng)基上加入不同劑量的妥布霉素，發(fā)現(xiàn)隨著劑量的增大，菌株因進(jìn)行適應(yīng)調(diào)整，生長速度減慢，死亡率增大。Tv?204菌株在10004000u/ml的平板上均可生長，最宜劑量為3000u/ml，此時生長周期為5d，菌落形態(tài)無明顯變異。經(jīng)耐受處理獲得效價提高11.5%的高產(chǎn)菌株，編號為Tt?49。 2.4 菌株Tt?49生長特性考察 (1)斜面優(yōu)質(zhì)孢子培養(yǎng)時間的確定 優(yōu)質(zhì)孢子的界定，用肉眼觀察或顯微鏡觀察都難以作出判斷。界定優(yōu)質(zhì)孢子還是以斜面培養(yǎng)時間結(jié)合搖瓶發(fā)酵效價的方法，考察它們的相關(guān)性。為

12、此設(shè)計了在其它條件相同的情況下，取不同培養(yǎng)時間的斜面進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，以發(fā)酵效價最高所對應(yīng)的斜面培養(yǎng)時間作為界定斜面優(yōu)質(zhì)孢子培養(yǎng)時間的準(zhǔn)則。經(jīng)反復(fù)考察，斜面培養(yǎng)96h最好，結(jié)果見表2。 (2)傳代對生產(chǎn)力穩(wěn)定性的影響 菌株傳代是否穩(wěn)定是決定能否進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵，為了考察所篩選菌株的傳代穩(wěn)定性，對Tt?49菌株連續(xù)傳代，第1代斜面Fl，第2代斜面F2，第3代斜面F3，第10代斜面F10，分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。經(jīng)測定，Tt?49菌株各子代發(fā)酵效價均落在48005300u/ml，波動較小，可以認(rèn)為是穩(wěn)定的。學(xué)術(shù)科研網(wǎng) (3)冷藏對穩(wěn)定性的影響 為了考察冷藏對斜面孢子穩(wěn)定性的影響， 將置于4冰箱保存不同時

13、間的 表2 斜面孢子培養(yǎng)時間對效價的影響 由表3可見，斜面在冰箱保存7d內(nèi)，對發(fā)酵效價影響不大；保存時間12d以上，不僅對種子的菌絲形態(tài)(鏡檢)，而且對發(fā)酵效價均有明顯的影響。因此建議采取低溫干燥予以保存，生產(chǎn)斜面以新鮮為宜。 2.5 種子特性考察 (1)種齡的確定 種齡控制不當(dāng)，影響菌種生產(chǎn)能力的發(fā)揮。移種過早，潛伏期較長，甚至長不起來，即使生長了也容易衰老；移種太晚，種子走向衰老，不利于發(fā)酵和合成抗生素。為此，考察了種子培養(yǎng)時間對發(fā)酵效價的影響，借此來確定合理的菌齡，結(jié)果見表4。 由表4可以看出，移種時間控制在1620h，對效價無太大影響，總效價均在4800u/ml以上。18h(pH6.7

14、4，菌濃10%)移種，發(fā)酵效價最高，此時種子液顏色轉(zhuǎn)黃，出現(xiàn)掛壁現(xiàn)象，鏡檢菌絲粗壯，分支多，染色深。當(dāng)接種時間延長到24h時，種子菌絲開始變細(xì)、變長，空胞逐漸增多，發(fā)酵效價反而有所降低。由表4數(shù)據(jù)還可以看出，種子的菌絲濃度高不等于種子質(zhì)量好，22h的種子濃度達(dá)12%，但最終發(fā)酵效價不高， 因此，表3 冷藏時間對生產(chǎn)力的影響 把握好合適的菌齡是把握好發(fā)酵的關(guān)鍵之一。 (2)接種量的確定 接種量的多少，決定了產(chǎn)生菌在發(fā)酵開始的生長繁殖速度和潛伏期的長短，同時也影響其最終產(chǎn)抗生素的水平，因此，確定菌齡之后，對接種量進(jìn)行考察。將培養(yǎng)18h的種子按不同接種量(1%，3%，5%，8%，10%，15%)接入

15、發(fā)酵瓶(40ml/250ml)，37，250r/min搖床培養(yǎng)110h，考察接種量對發(fā)酵效價的影響，結(jié)果顯示接種量10%時發(fā)酵效價最高。 (3)溶氧對發(fā)酵效價的影響 溶解氧對妥布霉素發(fā)酵至關(guān)重要10，11。菌體在自身生長、繁殖及合成次級代謝產(chǎn)物的過程中都需要一定量的氧氣。溶氧過低，影響菌體的生長和產(chǎn)物的合成，特別是影響糖的代謝；但過大的溶氧量導(dǎo)致菌絲瘋長，對生產(chǎn)不利。妥布霉素發(fā)酵中黑暗鏈霉菌的生長是為了達(dá)到一定的菌密度，以便在分泌期有更多的菌體起作用，如果某些養(yǎng)分過于充足，造成菌絲瘋長，在顯微鏡里觀察到又粗又長的菌絲體，發(fā)酵液變得很稠，但妥布霉素的效價卻很低。 發(fā)酵罐上可以通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速或攪

16、拌葉和空氣流量來控制溶氧，搖瓶上則通過改變裝料量和紗布層數(shù)來控制，以發(fā)酵效價為指標(biāo)，確定溶氧條件。 本實驗通過在250ml發(fā)酵瓶中改變發(fā)酵培養(yǎng)基裝量來模擬發(fā)酵過程中提供不同的溶氧濃度，考察不同溶氧濃度對妥布霉素發(fā)酵效價的影響，結(jié)果見表5。 由表5的結(jié)果可以看出，搖瓶裝量對發(fā)酵效價有一定的影響，其中以裝量40ml效價最高。15ml/250ml的裝料量供氧過多，菌絲瘋長，大量底物消耗于生長，對次級代謝不利， 效價較低； 50ml/250ml的裝料量供表4 種齡對效價的影響表5 不同裝料量對效價的影響氧不足，菌生長受到限制，菌絲過早斷裂，由于沒有足夠的菌密度，效價上升緩慢，底物消耗大，最終效價也低。

17、此外，發(fā)現(xiàn)隨著裝量的增加，發(fā)酵終點的pH值呈逐漸下降的趨勢，可能是溶氧過低，影響糖的有氧代謝，導(dǎo)致一系列酸性代謝產(chǎn)物的積累而使pH下降。 2.6 發(fā)酵代謝曲線 根據(jù)以上對工藝條件初步研究所取得的結(jié)果，進(jìn)一步擴大到50L發(fā)酵罐進(jìn)行驗證，定時取樣，測定各主要參數(shù)(pH、相對菌絲濃、效價，DO2、總糖、還原糖和氨基氮等)，繪制發(fā)酵代謝圖(圖1)。 由圖1可以看出，高產(chǎn)菌Tt?49在妥布霉素發(fā)酵過程中pH先升后降再升，變化平緩。發(fā)酵前期(030h)，pH由自然升到7.5左右，此階段為菌體快速生長期，大量利用碳源，總糖、還原糖急劇降低，菌濃不斷升高；中期(3090h)pH略有下降并維持在7.2左右，此時

18、為生產(chǎn)期，不斷消耗營養(yǎng)物質(zhì)合成次級代謝產(chǎn)物，是提高效價的關(guān)鍵時期；90h后pH逐漸升高，此時菌體開始自溶，表現(xiàn)為pH開始上升，菌濃不斷降低，堿性產(chǎn)物不斷被分泌到胞外引起pH不斷升高。 3 小結(jié) 紫外誘變結(jié)合耐受處理是篩選氨甲酰妥布霉素高產(chǎn)菌株的有效手段。本研究通過此獲得比出發(fā)菌株增產(chǎn)180%的高產(chǎn)菌株Tt?49，發(fā)酵水平達(dá)5865u/ml。高產(chǎn)菌株Tt?49斜面生長周期4d，傳代穩(wěn)定，可冷藏7d，種齡18h，接種量10%。溶解氧對于黑暗鏈霉菌的深層發(fā)酵至關(guān)重要，發(fā)酵罐上可通過改變攪拌轉(zhuǎn)速和改變通氣量來改變?nèi)苎鯘舛取?根據(jù)溶氧曲線，優(yōu)化發(fā)酵工藝，獲得一套較適合氨甲酰妥布霉素高產(chǎn)菌株Tt?49的代

19、謝曲線特性圖。按照該曲線特性圖進(jìn)行調(diào)控，可使抗生素生產(chǎn)水平接近于搖瓶的生產(chǎn)水平，充分發(fā)揮了菌株的抗生素生物合成潛力，達(dá)到了較為理想的效果。【參考文獻(xiàn)】 1 李家斌，趙鳳培. 硫酸妥布霉素治療急性細(xì)菌性痢疾J. 中國抗生素雜志，1997，22(2)：159160.2 楊文鋒，夏煥章，蘇顯英. 氨甲酰妥布霉素高產(chǎn)菌株的誘變選育J. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2006，23(1)：5759.3 劉曉輝，熊宗貴，吳建梅，等. 單組分妥布霉素產(chǎn)生菌的選育J. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2002，19(3)：214217.4 Borodina I, Scholler C, Eliasson A, et al. Metabolic network analysis o