石蠟包埋組織的dna提取及其應(yīng)用

1、石蠟包埋組織的DNA提取及其應(yīng)用近io年來，現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)越來越廣泛地被用于人類疾病研究的諸領(lǐng)域，為了解病理狀態(tài)下基因組DNA的變化積累了新資料。目前認(rèn)為，人類基因組并非人們想像的那樣穩(wěn)定，諸如基因重排、擴(kuò)增、缺 失，突變和DNA甲基化類型改變等時有發(fā)生，這些改變對于基因表達(dá)和調(diào)控，以及疾病過程的發(fā)展與轉(zhuǎn)歸等方面均具有重要意義。醫(yī)院病理科檔案中積存的大量石蠟包埋組織，是一個可靠的分子生物學(xué)研究的材料來源。在石蠟切片 上進(jìn)行原位雜交或原位 PCR分析的分子生物學(xué)方法，是免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的重要延伸。通過對 DNA或m RNA分析亦可直接證實或補(bǔ)充免疫細(xì)胞化學(xué)的發(fā)現(xiàn)。這些對形態(tài)學(xué)家較為熟悉的原位

2、分子生物學(xué)技術(shù)，本 節(jié) 不再贅述。Goelz（1985）和Dubeau等（1986 ）成功地從蠟塊中提取出高質(zhì)量的DNA ,完全可以滿足某些腫瘤分子生物學(xué)研究的需要，結(jié)束了 DNA研究依賴于新鮮或冰凍組織和細(xì)胞的歷史，而且可以廣泛地應(yīng)用于大宗病例的回顧性研究，對腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制的探討，診斷與鑒別診斷研究和患者預(yù)后評估等方 面均具有重要價值。本節(jié)重點(diǎn)討論石蠟包埋組織 DNA提取的方法學(xué)及其潛在的應(yīng)用前景。一、石蠟包埋組織DNA提取的基本方法從石蠟包埋組織中提取 DNA的基本步驟，是在常規(guī) DNA提取方法的基礎(chǔ)上改良和演變而來。Goelz等（ 1985）最先提出的石蠟包埋組織 DNA提取技術(shù)（表

3、18-5）,是用機(jī)械的方法破碎組織，切除多余的 石蠟，直接進(jìn)入含SDS和高濃度蛋白酶K （1mg/ml ）的提取緩沖液加溫孵育，然后進(jìn)行苯酚和氯仿抽提。 所彳t DNA雖不完整，但可被限制性內(nèi)切酶切割，因而適于點(diǎn)雜交，印跡雜交等多種分子生物學(xué)實驗。Dubeau等（ 1986）在上述方法上作了改進(jìn)。首先通過組織切片用二甲苯脫蠟，保證了組織的完全破碎，使 細(xì)胞與消化液充分接觸，使DNA釋放和蛋白去除更加完全；其次通過兩步消化的方法，將不適于做分子雜 交的降解的DNA小片段去除，僅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子，從而提高了 DNA質(zhì)量，適于做Southern印跡雜交分析。Moerkerk等（1

4、990 ）對上述兩種方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法所取得DNA之點(diǎn)雜交結(jié)果一致，非螺旋化 DNA亦不影響雜交分析。表18-5 Gpelz氏DNA提取方法的主要步驟1 .切除多余石蠟，暴露組織2 .將組織切碎（最大徑 <0.5mm ）,稱重；3 .溶于TE9提取液（組織<50mg/5ml,50500mg/10ml ），高速混懸23min ;于48 放置24h ,其制備 見表18-6;4 .再次混懸組織，加入蛋白酶K至終濃度1mg/ml,SDS至2% ,孵育40h ;5 .用等體積酚-氯仿溶液抽提3次；6 . 2.5倍體積乙醇沉淀DNA7 . -70 C放置24h8 . 9000 Xg

5、離心 1h9 .沉淀物用70%乙醇洗1次10 .干燥，TE （pH7.2）溶解.表18-6 TE9 DNA提取液的制備500mmol/LTris20mmol/LEDTA10mmoo/LNaCl1%SDS500 ii g/ml蛋白酶KPH8.05 Vm組織切片常規(guī)脫蠟、水化第一次溶液A孵育（去上清）第二次溶液A孵育（留上清）氯仿-異戊醇抽提RNA酶和蛋白酶消化酚抽提沉淀（卻除未螺旋化DNA） J透析圖18-6 石蠟包埋組織 DNA提取流程（Drbeau等，1986）溶液A2XSSC100 Vg蛋白酶K/ml1% SDS不同類型的基因分析所要求的DNA質(zhì)量長數(shù)量不同。Southern印跡雜交分析需

6、要1015“g大片段DNA （20kb）,因為雜交前要進(jìn)行相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化和凝膠分離不同片段長度的DNA。故DNA提取要求高，小片段 DNA存在會直接影響雜交信號。與之相反，多聚酶鏈反應(yīng)（ PCR）則可在相對粗制的 小片段DNA樣本上進(jìn)行，分析所需的 DNA很少，0.5從g甚至更少即可。PCR的模板DNA制備方法很多， 除上述兩種方法外，還有更簡便的直接水煮法（ Sle bos,et al, 1990 ; Smit, et al. 1988 ）、蛋白酶消化 法（Impraim et al. 1987 ; Brice, et al. 1989）。這些方法不經(jīng)過酚-氯仿-異戊醇抽提、DNA純

7、化等步驟， 直接將組織放在去離子水中煮沸10min或在蛋白酶K緩沖液中消化4h , DNA即可釋放出來。此提取物可直接用作模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，但是，我們發(fā)現(xiàn)直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA ,擴(kuò)增率較低，且重復(fù)性不好。這可能是由于DNA附著的蛋白質(zhì)去除不凈而影響DNA變性和引物的結(jié)合，亦可能是由于標(biāo)本中殘留的固定劑等成分對Taq DNA多聚酶的抑制所致。二、影響DNA提取質(zhì)量的因素1 .固定劑對DNA的影響固定劑的類型直接影響提取DNA的質(zhì)量。目前大多數(shù)實驗室常用的中性緩沖福爾馬林固定的標(biāo)本，DNA保存完好，可以獲得高分子量DNA。Warford等（ 1988 ）對甲醛固定過程中DNA

8、變化進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)核酸對甲醛反應(yīng)性可分為兩個階段：早期出現(xiàn)堿基快速可逆性羥甲基化；數(shù)天后堿基對間核酸與蛋白間緩慢地形成亞甲基交聯(lián)。DNA提取過程中的蛋白酶 K消化，酚/氯仿抽提和純化等步驟，可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性質(zhì)改變。bramwell等（ 1988 ）發(fā)現(xiàn)，甲醛和戊二醛固定可使得 DNA產(chǎn)量降低，醋酸甲醇（MAA ）可導(dǎo)致DN A明顯降解。Michel S運(yùn)輸保存液或PBS存放組織雖提取 DNA純度高，但產(chǎn)量明顯降低。Dubeau等也觀 察到含苦味酸（Bouin氏液）和含氯化汞的固定液（Zenker,Bs ）處理標(biāo)本不能獲得完整的 DNA。乙醇被認(rèn)為是保存核酸的最佳固定劑

9、。Wu等（ 1990）用無水乙醇固定標(biāo)本 48h ,最長達(dá)2年，均可得到中量的高分子 DNA。每mm3乙醇固定標(biāo)本平均 DNA產(chǎn)量為26.6 “g高于新鮮標(biāo)本（19.4 g/mm3）。 經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，乙醇固定組織DNA均顯示由于重復(fù)DNA序列存在所產(chǎn)生的特征性衛(wèi)星帶，說明DNA被完成消化。Southern印跡雜交結(jié)果與冰凍組織一致。Sato等（ 1990）用AMex方法處理組織，既可保存許多抗原成分，亦可使大分子量DNA完好無損。其基本方法為：將組織放至 4c丙酮浸透，移至-20C過夜。然而再用丙酮分別在 4'°和室溫脫水各15min , 苯甲酸透明兩次，每次 15m

10、in ,最后60 c真空浸蠟23h,石蠟包埋。結(jié)果顯示，每 10mg AMex法處理 的濕重組織提高分子量 DNA71.處14.53 gg ,與新鮮組織產(chǎn)量相當(dāng)（70.4 + 13.76。酶切、電泳和雜交反應(yīng)亦相同于新鮮組織。提示AMex 法是一種多用途組織處理技術(shù)，可以克服由于DNA 降解、高分子量DNA 減少和內(nèi)切酶不完全消化所產(chǎn)生的電泳類型改變，是一種理想的DNA 保存方法，特別適用于對形態(tài)學(xué)、免疫表型和基因改變的相關(guān)性分析。2 固定時間對DNA 的影響固定過程中所發(fā)生的組織反應(yīng)至今尚未被完全更理解，雖然理論上講室溫下福爾馬林與DNA 幾乎不發(fā)生反應(yīng)，但已發(fā)現(xiàn)堿基與組蛋白之間的甲基交聯(lián)。

11、這種福爾馬林介導(dǎo)的甲基化直接影響DNA 提取的效率。如果事實果真如此，那么固定的時間是一個重要的變異因素。然而，Goelz 等沒有發(fā)現(xiàn)固定時間對DNA 提取質(zhì)量的明顯影響。Dubeau 等認(rèn)為組織固定時間太短或太長均會導(dǎo)致DNA的降解。該作者對固定12h 到 5 天不同時間間隔標(biāo)本的DNA 提取顯示，隨著固定時間的延長，可螺旋化( Spoolable )的高分子量DNA 明顯減少。固定5 天后可螺旋化DNA 提取率僅有8%。 Warford 等也發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞懸液經(jīng)30min 福爾馬林固定后，DNA 產(chǎn)量減少到30% ，由此可見，不同標(biāo)本對不同固定劑所需的最佳固定時間應(yīng)摸索選定。根據(jù)Dubeau

12、等經(jīng)驗，常規(guī)組織固定應(yīng)在12h 以上至 110 之內(nèi)。3 固定溫度等其他因素對DNA 的影響核酸與固定劑的反應(yīng)由反應(yīng)成分、濃度、酸鹼度以及溫度等因素的調(diào)節(jié)， 其中溫度效應(yīng)顯得特別重要。室溫下 DNA 雙股螺旋鏈表現(xiàn)為兩條由氫鍵連接在互補(bǔ)多聚核苷酸；加熱到65 時，氫鍵開始斷裂；約90 時，產(chǎn)生兩條單鏈分子。在此變性狀態(tài)下，甲醛與酸反應(yīng)很快，通過羥甲基化作用可抑制DNA 冷卻后的再復(fù)性。最近， Koshiba 等發(fā)現(xiàn)福爾馬林固定過程中的DNA 降解，是由于固定溫度高，pH 低以及甲酸的存在所致。通過應(yīng)用緩沖福爾馬林和低溫下固定(4 )，可以明顯改善DNA 保存。酸性環(huán)境中DNA 的降解已有過深入

13、的研究。一般認(rèn)為，強(qiáng)酸可導(dǎo)致DNA 的完全解聚，而弱酸也能引起一些結(jié)構(gòu)的改變。當(dāng)pH 達(dá)到 2.5 以下時，幾乎所有的堿基之間氫鍵解離，使DNA 雙鏈斷裂而產(chǎn)生不可逆的變性；隨后出現(xiàn) N-糖昔鍵水解，使嗯吟殘基游離；最后，多聚核昔之磷酯鍵緩慢水解，僅殘留具有完整嘧啶的多聚脫氧核糖短臂。上述改變亦受溫度或離子強(qiáng)度的影響。加入鹽或降低溫度可穩(wěn)定氫鍵，因而可防止酸性條件下的DNA 變性。然而，即使福爾馬林被氫氧化鈉中和，在室溫下DNA 亦發(fā)生降解，提示福爾馬林本身即可降解 DNA。福爾馬林中DNA降解的機(jī)理及其預(yù)防有待于進(jìn)一步研究。4 組織處理過程對DNA 的影響我們發(fā)現(xiàn)，從常規(guī)組織處理的蠟塊中提取

14、的DNA， 其大部分分子量在100bp1000bp之間，主要分布于1001500bp ,僅約1/3的組織所提取 DNA>20kb 。這除與固定劑、 固 定時間等因素有關(guān)外，可能的原因還有： 組織從外科切除到固定之間的時間長短不一。當(dāng)組織未固定或固定不充分時，核酸酶可自由作用； 不同腫瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不發(fā)揮作用； 蠟塊貯存的時間長短不一。雖然從不同貯存時間的蠟塊中提取的DNA 大小無絕對區(qū)別，但新近的蠟塊比貯存 10 年以上的標(biāo)本所獲得的DNA 分子量大?？赡芟瀴K中仍存在導(dǎo)致DNA 降解的因素。組織的浸蠟和包埋溫度過高或時間過長，均可導(dǎo)致DNA 變性，而產(chǎn)生單鏈D

15、NA 片段。單鏈DNA 不能被限制性內(nèi)切酶所消化，可導(dǎo)致電泳時泳動速率變慢。三、提高DNA 提取質(zhì)量的方法1 蠟塊的選擇從福爾馬林固定的組織標(biāo)本中未能提出完整的高分子量DNA 的重要原因之一，是應(yīng)用了固定不充分的組織。因此，在DNA 提取前應(yīng)檢查組織切片。如果有自溶、退變或組織結(jié)構(gòu)不清，大片出血等改變的蠟塊不能用；若有明顯壞死存在的蠟塊，最好不用或?qū)乃啦糠智腥ズ笤儆?。盡可能地選用新 近標(biāo)本，緩沖福爾馬林、丙酮和乙醇固定者最佳。2 DNA 提取方法學(xué)的改善為了提高石蠟包埋組織DNA 提取的質(zhì)量和效益，人們從不同方面進(jìn)行了探索。 其中在 DNA 提取液的改良，蛋白酶的消化時間和DNA 純化等問題

16、上取得了進(jìn)展。 DNA 提取液主要含 SDS 和蛋白酶K 的 TE 緩沖液。固定和包埋組織由于化學(xué)修飾作用，使得DAN 與蛋白質(zhì)不易分離。因此，必須增加SDS和蛋白酶K的濃度和作用時間：SDS可增至1%2%,蛋白酶K200500“ g/ml ,最 高可達(dá)1mg/ml ;作用時間一般為24天，最長可達(dá)7天。蛋白酶K可分次加入，并注意不時震搖，使酶 與組織充分接觸。Koshiba 等發(fā)現(xiàn)， 利用 Goelz 等和 Dubeau 等提出的DNA 提取方法，不能夠得到令人滿意的完整DNA。尿素和服（guanidine ）是DNA自然和人工交聯(lián)最有力的剝脫劑，2-疏基乙醇可干擾二硫鍵，促進(jìn)蛋白變性。作者

17、對DNA 提取液進(jìn)行了改良，加入高濃度（4mol/L ）尿素和2-巰基乙醇。應(yīng)用此緩沖液，有效地從包埋組織中獲得高質(zhì)量DNA。 DNA 釋放率對于不同的組織類型是有差異的，取決于組織細(xì)胞密度和細(xì)胞外間質(zhì)的多少。對于細(xì)胞豐富、含有很少間質(zhì)的組織（例如脾臟），通過24h 孵育 80% 以上 DNA 可釋放出來；相同量的DNA 釋放對于富含致密間質(zhì)的子宮肌瘤則需要6 天時間；轉(zhuǎn)移性畸胎瘤含中等細(xì)胞密度和疏松的間質(zhì)，DNA 釋放率亦為中等。由此可見，對不同類型的組織DNA 提取，蛋白酶K的孵育時間可作適當(dāng)調(diào)整，以求最大量地獲取大分子DNA。止匕外，對于Dubeau等提出的DNA提取過程中分次消化步驟的

18、必要性，也有人提出異議。因為低、中分子量的核酸存在對限制性內(nèi)切酶的消化和雜交不起作用。 Dubeau等發(fā)現(xiàn)，不適于進(jìn)行酶切反應(yīng)和雜交研究的化學(xué)修飾的DNA ,可通過攪起完整的 DNA 而被動除去，因而強(qiáng)調(diào)了螺旋化（spooling ）在 DNA 純化中的重要性。該作者還發(fā)現(xiàn)延長組織固定時間的影響之一就是減少了可螺旋化DNA 的量，雜交分析顯示，螺旋化DNA 雜交信號強(qiáng)，而未螺旋化 DNA 信號減弱。因此，增加DNA 螺旋化可提高提取DNA 質(zhì)量和雜交效率。但是，Moerkert 等認(rèn)為未螺旋化 DNA 不影響進(jìn)行點(diǎn)雜交分析。3避免 DNA 機(jī)械性損傷福爾馬林固定和石蠟包埋使組織變得堅韌，很難達(dá)

19、到勻漿的效果。經(jīng)常的做法是將組織切成35Mm薄片，使每一細(xì)胞都被切開。但是，我們認(rèn)為切片太薄，容易過多地將DNA切斷， 影響高分子量DNA的獲得率。最好是采用1520Mm的厚切片。高濃度蛋白酶K消化24天，使能達(dá)到 細(xì)胞充分破碎、蛋白充分消化的目的。并盡可能避免機(jī)械性勻漿過程造成的DNA 剪切。此外， 在 NDA 釋放出來以后的提取過程中，應(yīng)盡可能輕柔操作，避免過多地移管。若必需移管時應(yīng)選用大口吸管。盡可能避免人為的DNA剪切。純化DNA用TE （pH8.0）溶解放4t保存即可，若短期不用時應(yīng) -20 凍存，但切忌反復(fù)凍融，以免DNA 降解。四、石蠟包埋組織DNA 分析的方法學(xué)由于 DNA 提

20、取方法的改善和DNA 質(zhì)量的提高，幾乎所有基因分析的技術(shù)均可用于石蠟包埋組織，但目前分子病理學(xué)研究的常用方法是點(diǎn)雜交、Southern 印跡雜交和多聚酶鏈反應(yīng)（PCR ）。1 點(diǎn)雜交鑒于包埋組織DNA 有一定程度的降解，因而點(diǎn)雜交被認(rèn)為是一種簡便、快速和實用的方法，特別適用于較大樣本的篩選。Dyall smith等（ 1988 ）采用未經(jīng)抽提的蛋白酶消化產(chǎn)物直接點(diǎn)膜，進(jìn)行點(diǎn)雜交分析，在3 周內(nèi)對 200 多病例進(jìn)行篩選，對陽性病例和很難解釋的弱陽性斑點(diǎn)，再進(jìn)行原位雜交等方法作進(jìn)一步證實。2 Southern 印跡雜交Southern 印跡雜交是經(jīng)典的基因分析技術(shù)，已被廣泛地用于基因突變，擴(kuò)增、

21、重排和丟失等許多方面的研究。石蠟包埋組織的Southern 印跡雜交分析有以下幾個方面值得注意：（1）當(dāng)所分析的酶切片段長為 300500bp時，包埋組織 DNA雜交信號強(qiáng)度只有相同量標(biāo)準(zhǔn)DNA的10%85% o信號強(qiáng)度與原始 DNA大小呈正相關(guān)，最小片段 DNA產(chǎn)生最弱的信號。（ 2 ）包埋組織DNA 所致的非特異性背景雜交比標(biāo)準(zhǔn)DNA 為明顯。這種背景雜交的產(chǎn)生可能是由于不包含到分析基因中兩個限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的小片段DNA 存在。（ 3）由于背景雜交明顯使得信號模糊，信/噪比縮小。根據(jù)Goelz 的經(jīng)驗，約有25% 石蠟包埋組織不適于作 Southern 印跡雜交。（ 4 ）某些限制性

22、酶切片段的電泳速度比標(biāo)準(zhǔn)DNA 稍遲緩?？赡艿脑蚴荄NA 直接或間接的化學(xué)改變使某些限制性酶切位點(diǎn)失活和/或單鏈DNA 存在。（ 5 ）由于小片段DNA 的存在，故用作雜交分析的DNA 量應(yīng)適當(dāng)增加，以增強(qiáng)雜交信號。3 PCR 分析 PCR 技術(shù)是近年來分子生物學(xué)技術(shù)的典范，已被廣泛地用于分子病理學(xué)的各個領(lǐng)域。此技術(shù)不但特異性好和敏感性高，而且簡便、快速、模板DNA 要求不高，特別適于石蠟包埋DNA 的分析。用于 PCR 擴(kuò)增的 DNA 提取比較簡單，既使少量DNA 樣品亦能產(chǎn)生大量特異性DNA 拷貝。 已被成功地用于各代木乃伊DNA 的分析，小至1mm2 的 HE 染色切片提取的DNA 亦

23、可獲得滿意的擴(kuò)增，并可用于診斷。但是，為了提高PCR 的敏感性和可重復(fù)性，模板DNA 應(yīng)盡可能地純化，除去提取物中某些抑制PCR 反應(yīng)的成份。此外，切片過程中要注意防止污染，以免出現(xiàn)假陽性。最近， Davis 等（ 1993 ）對 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行單鏈構(gòu)型多態(tài)性（SSCP ）分析，可以提高PCR 敏感性 5倍以上。 SSCP 分析是應(yīng)用單鏈DNA 在非變性聚丙酰胺凝膠上電泳，根據(jù)序列的不同所產(chǎn)生的構(gòu)型差異來分析 PCr 產(chǎn)物。此分析能檢測出小到一個堿基的差異，因而可被廣泛地用于研究點(diǎn)突變和基因多態(tài)性。此外， 在包埋組織的DNA 提取中往往發(fā)現(xiàn)有RNA 的存在。 這些未加任何保護(hù)而免受降解的RN

24、A， 不可能是完整的序列。然而， 此發(fā)現(xiàn)提示用福爾馬林固定的組織亦可作為Northern 印跡雜交分析的可能材料來源。五、分子病理學(xué)研究中的應(yīng)用1 基因重排分析與淋巴瘤的診斷分子生物學(xué)技術(shù)在腫瘤診斷中的應(yīng)用，目前僅限于淋巴瘤/白血病。淋巴瘤以具有特異性抗原受體基因重排的單一性細(xì)胞增殖為特征。因此，克隆性免疫球蛋白（Ig）和T-細(xì)胞受體 （ TCR） 基因重排的檢出可作為淋巴瘤診斷的重要指標(biāo)，這在國外許多實驗室已成為常規(guī)診斷技術(shù)。Southern 印跡雜交和PCR 都已被成功地用于基因重排分析。此技術(shù)在下列病變的診斷和鑒別診斷中特別有意義： 惡性淋巴瘤與反應(yīng)性淋巴組織增生的鑒別。后者為多克隆性細(xì)

25、胞增生，不能檢出或擴(kuò)增出克隆性基因重排序列； T和B細(xì)胞性腫瘤的區(qū)分：PCR3基因重排支持T細(xì)胞源性，而Ig重鏈基因則為B 細(xì)胞源性。然而，一部分病例顯示Ig 和 TCR 基因雙重排。在這種情況下，要結(jié)合其他基因分析。若同時伴有 Ig 輕鏈 （ K 或人） 基因重排則支持B 細(xì)胞腫瘤；同時伴有TCRr 或 TCRs 基因重排則為T 細(xì)胞腫瘤。 另外，也可結(jié)合免疫分型。雙基因重排的腫瘤往往一種基因為不完全重排、不伴有相應(yīng)的抗原受體表達(dá)，故免疫表型上往往是單一的。 T 細(xì)胞性淋巴瘤的診斷，T 細(xì)胞腫瘤形態(tài)變化多端、免疫表型上無克隆性標(biāo)記，故對此類淋巴瘤均有必要進(jìn)行基因分型。 T 細(xì)胞優(yōu)勢性B 細(xì)胞

26、淋巴瘤。這種腫瘤在形態(tài)和免疫表型上很難建立診斷。 殘留病變監(jiān)測和復(fù)發(fā)的早期診斷。此技術(shù)還可用于識別骨髓的累及、治療或骨髓移植后殘余病變的檢測，以及形態(tài)學(xué)上不能察覺的早期復(fù)發(fā)的診斷。</P< p>某些淋巴瘤/白血病所伴有的特異性染色體易位是另一種類型的基因重排標(biāo)記。例如濾泡型淋巴瘤中常出現(xiàn)的 t（ 14： 18）易位，Burkitt 氏淋巴瘤的t（8：14）、t（8：2）和t（8：22）易位，以及慢?；蚣绷馨籽≈谐Ｒ姷膖（ 9： 33）易位。因上述基因重排在淋巴瘤中出現(xiàn)頻率不高，故診斷應(yīng)用價值不大。2癌基因與抗癌基因的研究分子生物學(xué)在腫瘤病理學(xué)中另一熱點(diǎn)是癌基因和抗癌基因的研

27、究。自從1981 年 Weinberg 等首先報道人癌基因分離成功以來，至今已有50 多種癌基因被發(fā)現(xiàn)，這些基因普遍存在于各種生物細(xì)胞中，對于細(xì)胞的生長和分化起著重要作用。在正常情況下，其表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控；病理狀態(tài)下，癌基因活化，表達(dá)失控，使細(xì)胞原有的正常生物學(xué)性狀發(fā)生改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞癌變。據(jù)報道，癌基因的結(jié)構(gòu)和功能改變見于造血系統(tǒng)、乳腺、粘膜鱗狀上皮、前列腺、肺、腎、消化道、膀胱、卵巢、消 化腺、神經(jīng)系統(tǒng)和軟組織等腫瘤。另一類基因稱抗癌基因或抑癌基因，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的有p53、 Rb、 DCC 、 WT1 和 NF1 等。其蛋白產(chǎn)物的功能是阻滯癌基因所編碼多肽的活性。因此，如果抗癌基因發(fā)生突變或

28、功能喪失，異常的癌基因產(chǎn)物表達(dá)失控，而誘發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤。此現(xiàn)象為見于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜、結(jié)腸、食管等各部位的腫瘤。目前，對人類腫瘤中癌基因和抗癌基因的檢測，已經(jīng)在腫瘤的分類、發(fā)病機(jī)理、腫瘤生物學(xué)行為和預(yù) 后的關(guān)系等方面與腫瘤臨床密切結(jié)合起來，并正在逐漸地應(yīng)用于腫瘤的診斷、鑒別診斷和治療。（ 1 ）癌變機(jī)理的研究：癌基因活化和抗癌基因失活在人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。已有大量證據(jù)表明，至少需要兩種以上的癌基因活化的協(xié)同作用才能使正常細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。目前研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)腫瘤有一種以上的癌基因過度表達(dá)，一種癌基因?qū)Π屑?xì)胞的永生化起重要作用，而另一種則促進(jìn)細(xì) 胞的永生化。（ 2 ）

29、腫瘤生物學(xué)待業(yè)和預(yù)后的研究：某些癌基因突變及其產(chǎn)物的過度表達(dá)與癌細(xì)胞的分化和惡性程度有關(guān)。目前研究最多的是 c prbB 2與乳腺癌的關(guān)系。許良中等（1992 ）發(fā)現(xiàn)，浸潤性導(dǎo)管癌中c erbB -2陽性表達(dá)率達(dá)67%以上，單純癌陽性率為26.5% ,而全部乳癌良性病變皆陰性。我們的研究發(fā)現(xiàn)，c -erbB 氣過度表達(dá)的乳腺癌預(yù)后不良，Schimmelpenning 等（ 1992 ）也報告伴有c prbB 2擴(kuò)增的導(dǎo)管內(nèi)癌易于發(fā)生周圍浸潤。此外，ras P21 在乳腺癌中的表達(dá)也有上述趨勢。（ 3 ）輔助診斷和鑒別診斷：bc1-2 基因已被用于濾泡型淋巴瘤與反應(yīng)性濾泡增生的鑒別診斷，前者陽性

30、表達(dá)率在80% 以上，而后者幾乎為陰性；ras 癌基因突變或過度表達(dá)有助于甲狀腺乳頭狀癌、乳腺導(dǎo)管癌、結(jié)腸腺癌等腫瘤的診斷；小細(xì)胞肺癌常伴有n myc突變。（ 4 ）癌細(xì)胞的組織發(fā)生：paget 氏病可分乳腺外（EPD ）和乳腺內(nèi)（MPD ）兩種。有關(guān)paget 細(xì)胞的起源問題仍有爭議。 許良中（1993）觀察了 c -erbB -2和p53在77例EPD和10例MPD中的表達(dá)， 認(rèn)為 MPD 中的 paget 細(xì)胞是來源于腺癌細(xì)胞而不是表皮的角質(zhì)層細(xì)胞。EPP 中的 paget 細(xì)胞也來源于腺癌細(xì)胞，但這種腺癌細(xì)胞與MPD 中的腺癌細(xì)胞不同，因為兩者基因表達(dá)不同。3 遺傳病的基因診斷遺傳病的

31、回顧性家族調(diào)查，可通過石蠟包埋組織完成。Mueller 等描述 1 例懷疑囊性纖維化（CF ）的死嬰，石蠟包埋組織是唯一的材料來源。應(yīng)用CF 基因標(biāo)記引物，對患兒和其父母的DNA 分別進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用相應(yīng)內(nèi)切酶消化并檢測限制性片段多態(tài)性。結(jié)果顯示父母和患兒在同一位點(diǎn)上有意義，表明患兒遺傳有突變型CF 基因，最后證實了CF 的診斷。另一種常見的遺傳病-肌營養(yǎng)不良癥（DMD）,是由Dystrophin基因的DNA序列畸變引起。Forstboefel 等用該基因的已知編碼DNA 序列，從一死嬰尸檢組織中得到的DNA 進(jìn)行選擇性PCR 擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn) DMD 基因的一關(guān)鍵部分缺失，進(jìn)而證實了DMD 的診斷。同樣可通過親代DNA 分析，區(qū)分遺傳性或散發(fā)性缺失。4 病理微生物的檢測核酸雜交和PCR 技術(shù)對病原微生物的檢測亦具有獨(dú)到之處，除其特異性和敏感性極高外，還可適用于