液相色譜法和高效液相色譜法

《儀器分析》液相色譜法高效液相色譜法

LiquidChromatographyForShort：LCHighPerformanceHP液相色譜法基礎(chǔ)知識液相色譜儀的維護主要內(nèi)容液相色譜儀的主要部件色譜基礎(chǔ)知識色譜起源石油醚碳酸鈣顆?；旌仙厣珟Х蛛x組分1903年俄國植物學家

M.S.Tswett提出經(jīng)典液相色譜

色譜基礎(chǔ)知識色譜法：利用組分在兩相間相互作用不同而進行分離的技術(shù)流動相：攜帶樣品流過整個系統(tǒng)的流體固定相：靜止不動的一相，色譜柱色譜定義色譜是一種分離技術(shù)色譜的主要目的是對混合物中的目標物分離和定量

根據(jù)流動相和固定相的狀態(tài)，分為：色譜的分類吸附色譜

根據(jù)分離原理，分為：色譜的分類分配色譜離子交換色譜空間排阻色譜柱色譜：填充柱、毛細管柱平面色譜：紙色譜、薄層色譜色譜的分類

根據(jù)固定相外形，分為：液相色譜法基礎(chǔ)知識液相色譜：以液體作為流動相的色譜分離方法適用于高沸點、大分子和熱穩(wěn)定性差的化合物的分離分析（70-80%化合物）流動相具有運載樣品分子和選擇性分離的雙重作用什么是HPLC?是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜，基于儀器方法的高效能分離手段：高精度、耐高壓的輸液泵，高性能的色譜柱，高靈敏度的檢測器……廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域：醫(yī)藥/環(huán)保/石化/生命科學/食品及農(nóng)業(yè)……HPLC的特點

分離性能好、選擇性高（同分異構(gòu)、旋光異構(gòu)）

靈敏度高（10-9～10-12g）

分析速度快（15-30min）

進樣量?。?-100uL）輸液泵柱溫箱進樣器檢測器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)液相色譜儀的主要部件儲液瓶高壓輸液系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)輸液泵進樣器色譜柱柱溫箱檢測器儲液瓶HPLC簡易流程圖輸液泵液相色譜對泵的要求：1.流速穩(wěn)定平滑，并且重現(xiàn)性好。2.可靠且充分的溶劑混合。3.有效的流速范圍，在0.1~10mL/min的范圍內(nèi)可以連續(xù)調(diào)節(jié)。4.密封性能好，耐腐蝕，容易清洗。5.能適用于梯度洗脫。柱塞式往復泵

等度洗脫輸液泵進樣器色譜柱柱溫箱檢測器單一或混合溶劑適用于組分較少的化合物分析混合器比例閥二元高壓梯度四元低壓梯度脫氣機梯度洗脫ABABCD前端峰分離度差

甲醇/水=8/2分析時間長，后端峰展寬靈敏度下降甲醇/水=6/495%30%甲醇濃度縮短分析時間，峰形好

等度洗脫效果

梯度洗脫效果輸液泵進樣器儲液瓶高壓輸液系統(tǒng)進樣器自動進樣器手動進樣器取樣位置時(Load)進樣位置時(Inject)樣品進入液相分析柱手動進樣器——六通閥進樣器輸液泵柱溫箱進樣器儲液瓶高壓輸液系統(tǒng)柱溫箱分析結(jié)果重現(xiàn)性好提高柱效降低柱壓保證檢測穩(wěn)定性

填料：如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球等色譜柱分類反相色譜柱：C18、C8正相色譜柱：硅膠、氰基、氨基離子交換色譜柱：SCX、SAX凝膠色譜柱：凝膠手性色譜柱：牛血清蛋白、AGP、環(huán)糊精等C18柱的使用注意點柱壓應(yīng)低于柱子的承受壓力柱溫在40℃左右，最高使用溫度為50℃緩沖液pH使用范圍為2～7硅膠在PH為3～4時穩(wěn)定性最好堿濃度越低，流動相含水量越低，硅膠越穩(wěn)定。輸液泵柱溫箱進樣器檢測器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)儲液瓶高壓輸液系統(tǒng)常用檢測器紫外檢測器（UV）二極管陣列檢測器（PDA）熒光檢測器（FL）示差折光檢測器蒸發(fā)光散射檢測器紫外檢測器（UV）EinEoutA=eCl

=-log(Eout/Ein)

朗伯比爾定律檢測池C:濃度l原理：基于被分析組分對特定波長紫外光的選擇性吸收優(yōu)點：1）靈敏度高

2）對溫度和流速不敏感

3）可用于梯度洗脫4）不破壞樣品，可與其他檢測器串聯(lián)缺點：僅適用于測定有紫外吸收的物質(zhì)二極管陣列檢測器（PDA）原理：普通UV-VIS檢測器是先用單色器分光，只讓特定波長的光進入流動池。而二極管陣列檢測器是先讓所有波長的光都通過流動池，然后通過一系列分光技術(shù)，使所有波長的光在接受器上被檢。得到的是時間、光強度和波長的三維譜圖。色譜圖光譜圖吸光度波長時間熒光檢測器（FL）原理：發(fā)熒光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子達到激發(fā)態(tài)，其返回到基態(tài)時發(fā)射光的現(xiàn)象即熒光，基于被分析組分發(fā)射的熒光強度進行檢測?；鶓B(tài)激發(fā)態(tài)S1S0激發(fā)（1）振動能（2）發(fā)射（3）優(yōu)點：1）靈敏度極高，是最靈敏的檢測器

2）選擇性好

3）對溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫缺點：僅適用于測定可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)可檢測物質(zhì)：多環(huán)芳烴、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、卟啉、兒茶酚氨等（具有對稱共軛體系）

液相色譜儀的維護HPLC的環(huán)境設(shè)置HPLC的日常操作條件：溫度：10～30℃相對濕度：<80％最好是恒溫、恒濕遠離高電磁干擾、高振動設(shè)備有良好的通風設(shè)施流動相的選擇采用“HPLC”級溶劑避免使用會引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對樣品有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測器相匹配溶劑等級水的等級超純水蒸餾水去離子水波長(nm)因為不純物的存在，去離子水的吸光率較高超純水中去除了無機和有機的污染物吸光率超純水去離子水溶劑等級HPLC用水可以通過以下幾個方面來得到：1專門的超純水機；2去離子水重蒸；3二次或三次重蒸水；4采用類似家用的凈水器；5市場上瓶裝的純凈水或蒸餾水（樂百氏純凈水）；6其它途徑。溶劑等級

不管采用何種途徑，配制流動相應(yīng)用新鮮水，放置時間越短，水質(zhì)越高。理想的HPLC用水應(yīng)為18.2MΩ的超純水，并通過0.22um的濾膜，除去熱源、有機物、無機離子及空氣等。有機溶劑的等級HPLC級優(yōu)級純分析純都經(jīng)過蒸餾和0.45μm的過濾(除纖維毛,未溶解的機械顆粒）優(yōu)級純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗氧化劑HPLC級經(jīng)過0.2μm的過濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)溶劑等級甲醇乙睛正己烷分析純級(實線）和HPLC級溶劑（虛線）的吸光度比較溶劑等級溶劑等級緩沖鹽的使用：

使用前必須過濾使用后一定要對柱子進行清洗，以免造成腐蝕、磨損及阻塞：首先用純水沖洗10-30min，再用甲醇沖洗30min(0.5-1ml/min)

易受到細菌和霉菌的影響

注意沖洗次序，不能直接用有機溶劑沖洗溶劑前處理過濾：0.45μm或更小孔徑濾膜目的：除去溶劑中的微小物理顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其在使用無機鹽配制的緩沖液的時候必須過濾。脫氣：除去溶解在流動相中或彼此混合而產(chǎn)生的氣泡氣泡對測定的影響：1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波溶劑前處理樣品處理使用適宜的流動相溶解樣品在溶劑選擇的時候，應(yīng)注意以下原則：

--減少溶劑峰，尤其是不可使用組分峰靠近溶劑峰的流動相

--保證樣品在流動相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中尤其在色譜柱中產(chǎn)生沉淀

2.進樣前最好使用0.45μm的膜進行過濾如果樣品很臟，要使用0.2μm的膜進行過濾泵的保養(yǎng)使用流動相盡量要清潔；進液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗；流動相更換時要防止沉淀；

避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡；每次分析結(jié)束后，要反復沖洗進樣口，防止樣品的交叉污染。色譜柱的保養(yǎng)1、在使用新柱之前，