液相色譜法和高效液相色譜法

《儀器分析》液相色譜法高效液相色譜法

LiquidChromatographyForShort：LCHighPerformanceHP液相色譜法基礎(chǔ)知識(shí)液相色譜儀的維護(hù)主要內(nèi)容液相色譜儀的主要部件色譜基礎(chǔ)知識(shí)色譜起源石油醚碳酸鈣顆粒混合色素色帶分離組分1903年俄國植物學(xué)家

M.S.Tswett提出經(jīng)典液相色譜

色譜基礎(chǔ)知識(shí)色譜法：利用組分在兩相間相互作用不同而進(jìn)行分離的技術(shù)流動(dòng)相：攜帶樣品流過整個(gè)系統(tǒng)的流體固定相：靜止不動(dòng)的一相，色譜柱色譜定義色譜是一種分離技術(shù)色譜的主要目的是對(duì)混合物中的目標(biāo)物分離和定量

根據(jù)流動(dòng)相和固定相的狀態(tài)，分為：色譜的分類吸附色譜

根據(jù)分離原理，分為：色譜的分類分配色譜離子交換色譜空間排阻色譜柱色譜：填充柱、毛細(xì)管柱平面色譜：紙色譜、薄層色譜色譜的分類

根據(jù)固定相外形，分為：液相色譜法基礎(chǔ)知識(shí)液相色譜：以液體作為流動(dòng)相的色譜分離方法適用于高沸點(diǎn)、大分子和熱穩(wěn)定性差的化合物的分離分析（70-80%化合物）流動(dòng)相具有運(yùn)載樣品分子和選擇性分離的雙重作用什么是HPLC?是一種區(qū)別于經(jīng)典液相色譜，基于儀器方法的高效能分離手段：高精度、耐高壓的輸液泵，高性能的色譜柱，高靈敏度的檢測(cè)器……廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域：醫(yī)藥/環(huán)保/石化/生命科學(xué)/食品及農(nóng)業(yè)……HPLC的特點(diǎn)

分離性能好、選擇性高（同分異構(gòu)、旋光異構(gòu)）

靈敏度高（10-9～10-12g）

分析速度快（15-30min）

進(jìn)樣量?。?-100uL）輸液泵柱溫箱進(jìn)樣器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)液相色譜儀的主要部件儲(chǔ)液瓶高壓輸液系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器儲(chǔ)液瓶HPLC簡易流程圖輸液泵液相色譜對(duì)泵的要求：1.流速穩(wěn)定平滑，并且重現(xiàn)性好。2.可靠且充分的溶劑混合。3.有效的流速范圍，在0.1~10mL/min的范圍內(nèi)可以連續(xù)調(diào)節(jié)。4.密封性能好，耐腐蝕，容易清洗。5.能適用于梯度洗脫。柱塞式往復(fù)泵

等度洗脫輸液泵進(jìn)樣器色譜柱柱溫箱檢測(cè)器單一或混合溶劑適用于組分較少的化合物分析混合器比例閥二元高壓梯度四元低壓梯度脫氣機(jī)梯度洗脫ABABCD前端峰分離度差

甲醇/水=8/2分析時(shí)間長，后端峰展寬靈敏度下降甲醇/水=6/495%30%甲醇濃度縮短分析時(shí)間，峰形好

等度洗脫效果

梯度洗脫效果輸液泵進(jìn)樣器儲(chǔ)液瓶高壓輸液系統(tǒng)進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣器手動(dòng)進(jìn)樣器取樣位置時(shí)(Load)進(jìn)樣位置時(shí)(Inject)樣品進(jìn)入液相分析柱手動(dòng)進(jìn)樣器——六通閥進(jìn)樣器輸液泵柱溫箱進(jìn)樣器儲(chǔ)液瓶高壓輸液系統(tǒng)柱溫箱分析結(jié)果重現(xiàn)性好提高柱效降低柱壓保證檢測(cè)穩(wěn)定性

填料：如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球等色譜柱分類反相色譜柱：C18、C8正相色譜柱：硅膠、氰基、氨基離子交換色譜柱：SCX、SAX凝膠色譜柱：凝膠手性色譜柱：牛血清蛋白、AGP、環(huán)糊精等C18柱的使用注意點(diǎn)柱壓應(yīng)低于柱子的承受壓力柱溫在40℃左右，最高使用溫度為50℃緩沖液pH使用范圍為2～7硅膠在PH為3～4時(shí)穩(wěn)定性最好堿濃度越低，流動(dòng)相含水量越低，硅膠越穩(wěn)定。輸液泵柱溫箱進(jìn)樣器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)儲(chǔ)液瓶高壓輸液系統(tǒng)常用檢測(cè)器紫外檢測(cè)器（UV）二極管陣列檢測(cè)器（PDA）熒光檢測(cè)器（FL）示差折光檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器紫外檢測(cè)器（UV）EinEoutA=eCl

=-log(Eout/Ein)

朗伯比爾定律檢測(cè)池C:濃度l原理：基于被分析組分對(duì)特定波長紫外光的選擇性吸收優(yōu)點(diǎn)：1）靈敏度高

2）對(duì)溫度和流速不敏感

3）可用于梯度洗脫4）不破壞樣品，可與其他檢測(cè)器串聯(lián)缺點(diǎn)：僅適用于測(cè)定有紫外吸收的物質(zhì)二極管陣列檢測(cè)器（PDA）原理：普通UV-VIS檢測(cè)器是先用單色器分光，只讓特定波長的光進(jìn)入流動(dòng)池。而二極管陣列檢測(cè)器是先讓所有波長的光都通過流動(dòng)池，然后通過一系列分光技術(shù)，使所有波長的光在接受器上被檢。得到的是時(shí)間、光強(qiáng)度和波長的三維譜圖。色譜圖光譜圖吸光度波長時(shí)間熒光檢測(cè)器（FL）原理：發(fā)熒光的化合物吸收光（UV或VIS），其分子達(dá)到激發(fā)態(tài)，其返回到基態(tài)時(shí)發(fā)射光的現(xiàn)象即熒光，基于被分析組分發(fā)射的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)?；鶓B(tài)激發(fā)態(tài)S1S0激發(fā)（1）振動(dòng)能（2）發(fā)射（3）優(yōu)點(diǎn)：1）靈敏度極高，是最靈敏的檢測(cè)器

2）選擇性好

3）對(duì)溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫缺點(diǎn)：僅適用于測(cè)定可產(chǎn)生熒光的物質(zhì)可檢測(cè)物質(zhì)：多環(huán)芳烴、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、卟啉、兒茶酚氨等（具有對(duì)稱共軛體系）

液相色譜儀的維護(hù)HPLC的環(huán)境設(shè)置HPLC的日常操作條件：溫度：10～30℃相對(duì)濕度：<80％最好是恒溫、恒濕遠(yuǎn)離高電磁干擾、高振動(dòng)設(shè)備有良好的通風(fēng)設(shè)施流動(dòng)相的選擇采用“HPLC”級(jí)溶劑避免使用會(huì)引起柱效損失或保留特性變化的溶劑對(duì)樣品有適宜的溶解度溶劑粘度要小與檢測(cè)器相匹配溶劑等級(jí)水的等級(jí)超純水蒸餾水去離子水波長(nm)因?yàn)椴患兾锏拇嬖?，去離子水的吸光率較高超純水中去除了無機(jī)和有機(jī)的污染物吸光率超純水去離子水溶劑等級(jí)HPLC用水可以通過以下幾個(gè)方面來得到：1專門的超純水機(jī)；2去離子水重蒸；3二次或三次重蒸水；4采用類似家用的凈水器；5市場上瓶裝的純凈水或蒸餾水（樂百氏純凈水）；6其它途徑。溶劑等級(jí)

不管采用何種途徑，配制流動(dòng)相應(yīng)用新鮮水，放置時(shí)間越短，水質(zhì)越高。理想的HPLC用水應(yīng)為18.2MΩ的超純水，并通過0.22um的濾膜，除去熱源、有機(jī)物、無機(jī)離子及空氣等。有機(jī)溶劑的等級(jí)HPLC級(jí)優(yōu)級(jí)純分析純都經(jīng)過蒸餾和0.45μm的過濾(除纖維毛,未溶解的機(jī)械顆粒）優(yōu)級(jí)純的純度比分析純大,但里面含有防腐劑和抗氧化劑HPLC級(jí)經(jīng)過0.2μm的過濾,且除去有紫外吸收的雜質(zhì)溶劑等級(jí)甲醇乙睛正己烷分析純級(jí)(實(shí)線）和HPLC級(jí)溶劑（虛線）的吸光度比較溶劑等級(jí)溶劑等級(jí)緩沖鹽的使用：

使用前必須過濾使用后一定要對(duì)柱子進(jìn)行清洗，以免造成腐蝕、磨損及阻塞：首先用純水沖洗10-30min，再用甲醇沖洗30min(0.5-1ml/min)

易受到細(xì)菌和霉菌的影響

注意沖洗次序，不能直接用有機(jī)溶劑沖洗溶劑前處理過濾：0.45μm或更小孔徑濾膜目的：除去溶劑中的微小物理顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其在使用無機(jī)鹽配制的緩沖液的時(shí)候必須過濾。脫氣：除去溶解在流動(dòng)相中或彼此混合而產(chǎn)生的氣泡氣泡對(duì)測(cè)定的影響：1）泵中氣泡使液流波動(dòng)，改變保留時(shí)間和峰面積2）柱中氣泡使流動(dòng)相繞流，峰變形3）檢測(cè)器中的氣泡產(chǎn)生基線波溶劑前處理樣品處理使用適宜的流動(dòng)相溶解樣品在溶劑選擇的時(shí)候，應(yīng)注意以下原則：

--減少溶劑峰，尤其是不可使用組分峰靠近溶劑峰的流動(dòng)相

--保證樣品在流動(dòng)相中的溶解度，避免樣品在系統(tǒng)中尤其在色譜柱中產(chǎn)生沉淀

2.進(jìn)樣前最好使用0.45μm的膜進(jìn)行過濾如果樣品很臟，要使用0.2μm的膜進(jìn)行過濾泵的保養(yǎng)使用流動(dòng)相盡量要清潔；進(jìn)液處的砂芯過濾頭要經(jīng)常清洗；流動(dòng)相更換時(shí)要防止沉淀；

避免泵內(nèi)堵塞或有氣泡；每次分析結(jié)束后，要反復(fù)沖洗進(jìn)樣口，防止樣品的交叉污染。色譜柱的保養(yǎng)1、在使用新柱之前，