抗原修復(fù)方法及注意事項(xiàng)

1、檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)法( 強(qiáng)烈推薦)1 . 適用范圍：適合于大量中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修復(fù)，其效果優(yōu)于微波修復(fù)法和直接煮沸修復(fù)法 ,使得免疫組化結(jié)果更加可靠2 .儀器設(shè)備：市售不銹鋼家用壓力鍋，大小尺寸可根據(jù)需要而定(內(nèi)徑 18cm 為好 )； 1000-1500W 電爐一臺(tái)；不銹鋼或耐高溫塑料切片架。3 .所需試劑：0.01M 檸檬酸型緩沖液， pH=4 .0 ±0.15 .操作步驟：(1)常規(guī)組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，浸泡于蒸餾水中待用。(2)取一定量 pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液(800-1500ml)于壓力鍋中，大火加熱直至沸騰；將脫蠟水化

2、后的組織切片置于不銹鋼或耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中。蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴汽，從噴汽開始計(jì)時(shí)， 1-2 分鐘后，壓力鍋離開熱源，冷卻至室溫(稍冷后，可在自來水籠頭下加速冷卻)，取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用 PBS(pH=6 .2-7.4)沖洗兩次，每次3分鐘(2X3')(3)按有關(guān)試劑盒的操作步驟執(zhí)行。5.注意事項(xiàng)：(1)加熱時(shí)間長(zhǎng)短的控制很重要，從組織切片放入緩沖液到高壓鍋離開火源的總時(shí)間控制在5-8 分鐘為好，時(shí)間過長(zhǎng)可能會(huì)使染色背景加深。(2)必須使用不銹鋼或耐高溫塑料切片架，不能使用銅架，以防緩沖液pH 值增高而導(dǎo)致掉片。(3)高壓鍋離開火源后

3、必須等緩沖液冷切后，才能把切片取出。(4)為防止組織脫落，玻片必須經(jīng)清潔處理后，涂覆Poly-L-Lysine(5)緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使用。EDTA抗原熱修復(fù)法1 . 適用范圍：適用于部分中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修復(fù)。2 .儀器設(shè)備：電磁爐、不銹鋼鍋和耐高溫塑料染色架。3 .所需試劑：EDTA抗原修復(fù)液，pH9 .04 .操作步驟：(1)抗原修復(fù)液的配制：根據(jù)所需工作液的量，取邁新公司產(chǎn)品 MVS-0098適量，按1:50的比例稀 釋。(2)取 500ml 抗原修復(fù)工作液于 1000ml 不銹鋼鍋中，直接在電磁爐上加熱至沸騰后，調(diào)低

4、電磁爐功率使鍋內(nèi)修復(fù)液保持微沸狀態(tài)。將組織切片置于耐高溫染色架上，再將染色架緩慢放入不銹鋼鍋中(注意：若快速將染色架丟進(jìn)緩沖液中，往往會(huì)導(dǎo)致瞬時(shí)的激烈沸騰現(xiàn)象而造成組織脫落)，之后加蓋繼續(xù)加熱20 分鐘。再將不銹鋼鍋從電磁爐上移開，室溫下自然冷卻至室溫后取出切片，蒸儲(chǔ)水洗 1次3分鐘，PBSa 2次、每次3分鐘 之后進(jìn)行免疫組化染色。5 .注意事項(xiàng)：(1)由于修復(fù)液蒸發(fā)量無法估計(jì)，所以修復(fù)液不能重復(fù)使用。(2)工作液的量必須保證切片始終能浸泡在液體內(nèi)。(3)為了防止加熱過程組織脫片，須采用Poly-L-Lysin覬理載玻片。(4)抗原修復(fù)后一定要等工作液冷卻后，才能將切片從工作液中取出。檸檬酸

5、緩沖液微波抗原修復(fù)法1 . 適用范圍：適合于大量中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修復(fù)，其效果比高溫高壓修復(fù)差但比直接水煮好。2 .儀器設(shè)備：微波爐 (700-800w)。3 .所需試劑：0.01M 檸檬酸型緩沖液， pH=4 .0 ±0.15 .操作步驟：(1)常規(guī)組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，浸泡于蒸餾水中待用。(2)取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液(緩沖液量不得<500ml)于微波盒中，微波加熱直至沸騰；將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，中高檔或中檔繼續(xù)微波處理15-20 分鐘；取出微波盒冷卻至室溫，從緩沖液中取出玻片，先

6、用蒸餾水沖洗兩次，之后用 PBS(pH=7.2-7.4)沖洗兩次，每次3分鐘(2X3')(3)按有關(guān)試劑盒的操作步驟執(zhí)行。5.注意事項(xiàng)：(1)微波時(shí)間長(zhǎng)短的控制很重要，從組織切片放入沸騰的緩沖液到微波結(jié)束的總時(shí)間控制在15-20 分鐘為好。(2)必須使用耐高溫塑料切片架，不能使用不銹鋼或銅架。(3)微波過程中，如果緩沖液蒸發(fā)而量減少，無法浸泡到組織片，應(yīng)該適當(dāng)加上一些蒸餾水，以保證組織片都能浸泡在緩沖液中，繼續(xù)微波。(4)微波結(jié)束后必須等緩沖液冷卻后，才能把切片取出。(5)為防止組織脫落，玻片必須經(jīng)清潔處理后，涂覆 Poly-L-Lysine( Dev腰沖 液的量(>500ml)

7、,必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù) 使用。檸檬酸緩沖液煮沸抗原修復(fù)法1 . 適用范圍：適合于中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織切片的抗原修復(fù)，其效果比高壓 修復(fù)法差。2 .儀器設(shè)備：電爐(600W)、燒杯(1000ml)等。3 .所需試劑：0.01M 檸檬酸型緩沖液， pH=4 .0 ±0.1)。5 .操作步驟：(1)常規(guī)組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化后，浸泡于蒸餾水中待用。(2)取一定量pH=6 .0 檸檬酸鹽緩沖液于燒杯中，放在電爐上加熱直至沸騰；將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，繼續(xù)煮 20 分鐘； 燒杯離開火源冷卻至室溫

8、，才能從緩沖液中取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用 PBS(pH=7 .2-1 .4)沖洗兩次，每次3分鐘(2X3')(3)按有關(guān)試劑盒的操作步驟執(zhí)行。5 .注意事項(xiàng)：(1)必須使用不銹鋼或耐高溫塑料切片架，不能使用銅架，以防 pH 值改變而 導(dǎo)致掉片。(2)煮好后必須等緩沖液冷卻后，方能將切片取出。(3)為防止組織脫落，玻片必須經(jīng)清潔處理后，涂覆Poly-L-Lysine(4)緩沖液的量必須保證所有切片都能浸泡到，用過的檸檬酸緩沖液不能反復(fù)使用。影響抗原熱修復(fù)的 xx免疫組織化學(xué)染色中最關(guān)鍵的步驟莫過于抗原的修復(fù)了，而絕大多數(shù)常用抗體的修復(fù)是通過加熱來完成的，可以這樣說，抗原熱修復(fù)

9、是免疫組化的關(guān)鍵技術(shù)，會(huì)直接影響到最終的染色結(jié)果。1 、抗原熱修復(fù)溫度和時(shí)間的關(guān)系組織固定液福爾馬林會(huì)引起組織蛋白內(nèi)或蛋白之間的亞甲基發(fā)生橋連，具體過程如示：上述反應(yīng)的結(jié)果導(dǎo)致許多抗原決定簇被封閉，而加熱可以水解該橋連使抗原被激活。影響抗原熱修復(fù)的兩個(gè)最關(guān)鍵的因素是溫度和時(shí)間，有人將這兩種因素對(duì)抗原修復(fù)的影響總結(jié)為下面的公式：抗原熱修復(fù)的有效性=加熱溫度（T）動(dòng)口熱時(shí)間（t）也就是說當(dāng)我們修復(fù)時(shí)的溫度越低則需要修復(fù)的時(shí)間就會(huì)越長(zhǎng)；反過來當(dāng)修復(fù)溫度增高時(shí)則修復(fù)的時(shí)間可以適當(dāng)?shù)乜s短，才能使抗原決定簇完全暴露，這種反比的關(guān)系從MBI 單克隆抗體的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表一中也可以清楚地看出。如果修復(fù)強(qiáng)度不夠，免疫

10、組織化學(xué)染色所顯示的只能是修復(fù)后暴露出的部分抗原決定簇，而不是組織所含的全部抗原。這樣的染色結(jié)果可能會(huì)非常弱，或出現(xiàn)假陰性，即使是陽(yáng)性結(jié)果，充其量只能起到定性的作用，不能適應(yīng)今后對(duì)免疫組化進(jìn)行定量的需要2、組織固定時(shí)間和所需的抗原熱修復(fù)的關(guān)系固定時(shí)間越長(zhǎng)的標(biāo)本，它所形成的橋連就越緊密，抗原就越難以被激活，所需要的修復(fù)強(qiáng)度也就越強(qiáng)。有意思的是隨著固定時(shí)間的延長(zhǎng)，組織中蛋白對(duì)溫度的耐受也會(huì)相應(yīng)增高，這可能就是我們對(duì)固定時(shí)間長(zhǎng)的標(biāo)本加大修復(fù)強(qiáng)度的理論基礎(chǔ)。這就提醒我們?cè)谧龌仡櫺匝芯繒r(shí)一定要注意所使用的修復(fù)條件，它與新鮮標(biāo)本的修復(fù)條件一定是有所區(qū)別的，同等條件下一定要加長(zhǎng)修復(fù)的時(shí)間或提高修復(fù)所使用的溫

11、度，才可能得到比較滿意的結(jié)果。3 、不同 pH 值抗原修復(fù)液對(duì)染色結(jié)果的影響抗原熱修復(fù)中所使用的修復(fù)液pH 值也會(huì)對(duì)染色結(jié)果產(chǎn)生相當(dāng)大的影響。 pH值對(duì)染色結(jié)果的影響大概可以分為以下四種情況。A 穩(wěn)定型， pH 值對(duì)染色結(jié)果的影響不大，如 PCNA、 AE1、 EMA、CD20等。BV型，高pH值和低pH值染色較好，而pH值4-6染色結(jié)果較差，如 ER Ki-67 等。C上升型，隨著pH值的增加，染色結(jié)果逐漸增強(qiáng)，如 HMB45等。D 下降型，隨著pH 值的增加，染色結(jié)果逐漸減弱，當(dāng)然這種類型的抗體只是個(gè)別的現(xiàn)象，如 MOC31。一個(gè)有趣的現(xiàn)象值得注意，即在高 pH 值（約 pH8.09.0）

12、，A、B、C三者都有較好的染色結(jié)果，所以目前比較推崇的抗原修復(fù)液為高 pH 值的修復(fù)液，如 1mM EDTA, pH8.0 或 pH9.0 等。但是由于傳統(tǒng)習(xí)慣，絕大多數(shù)醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室都在使用 pH6.0 的枸櫞酸緩沖液。綜合以上各種抗體的染色狀況，考慮到臨床工作的實(shí)際情況，許多國(guó)外免疫組化專家建議，在常規(guī)的免疫組化工作中，全部選用高pH 值的修復(fù)液來代替目前廣為使用的 pH6.0 枸櫞酸緩沖液。為此，本公司已經(jīng)推出 pH8.0 和 pH9.0 的新型抗原修復(fù)液。經(jīng)驗(yàn)證，絕大多數(shù)的抗體使用 pH9.0 的修復(fù)液效果都要優(yōu)于 pH6.0 的枸櫞酸，尤其是核陽(yáng)性的抗體。所以，在常規(guī)的免疫組化工作中，使用高 pH 值的抗原修復(fù)液是今后的必然趨勢(shì)。4、