聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物克隆

1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物克隆第一節(jié) 概 述 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應(yīng))是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA的方法.它包括三個基本步驟: (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94下解鏈; (2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最適溫度下,以目的DNA為模板進(jìn)行合成.由這三個基本步驟組成一輪循環(huán),理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA擴(kuò)增一倍,這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經(jīng)

2、25-35輪循環(huán)就可使DNA擴(kuò)增達(dá)106 倍。一、 PCR反應(yīng)中的主要成份1. 引物：PCR反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關(guān)鍵。引物設(shè)計(jì)和選擇目的DNA序列區(qū)域時(shí)可遵循下列原則：(1) 引物長度約為16-30bp， 太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費(fèi),且難以合成。(2) 引物中G+C含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計(jì)引物的解鏈溫度 Tm4(G+C)+2(A+T).(3) 四種堿基應(yīng)隨機(jī)分布，在3'端不存在連續(xù)3個G或C,因這樣易導(dǎo)致錯誤引發(fā)。(4) 引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或

3、第二位核苷酸對應(yīng), 以減少由于密碼子擺動產(chǎn)生的不配對。(5) 在引物內(nèi), 尤其在3'端應(yīng)不存在二級結(jié)構(gòu)。(6) 兩引物之間尤其在3'端不能互補(bǔ), 以防出現(xiàn)引物二聚體, 減少產(chǎn)量。兩引物間最好不存在4個連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。 (7) 引物5'端對擴(kuò)增特異性影響不大, 可在引物設(shè)計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)、核糖 體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、缺失或插入突變位點(diǎn)以及標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等. 通常應(yīng)在5'端限制酶位點(diǎn)外再加1-2個保護(hù)堿基。(8) 引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)。所擴(kuò)增產(chǎn)物本身無穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu), 以免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增,影響產(chǎn)量。 (9) 簡并引物應(yīng)選用簡

4、并程度低的密碼子, 例如選用只有一種密碼子的Met, 3'端應(yīng)不存在簡并性。否則可能由于產(chǎn)量低而看不見擴(kuò)增產(chǎn)物。一般PCR反應(yīng)中的引物終濃度為0.2-1.0mol/L。引物過多會產(chǎn)生錯誤引導(dǎo)或產(chǎn)生引物二聚體, 過低則降低產(chǎn)量。利用紫外分光光度計(jì), 可精確計(jì)算引物濃度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物濃度可按下式計(jì)算：X mol/L OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600) X: 引物摩爾濃度,A、C、G、T: 引物中4種不同堿基個數(shù)。 2. 4種三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)：dNTP應(yīng)用NaOH 將pH調(diào)至7.0,并用分光光度計(jì)測定其

5、準(zhǔn)確濃度.dNTP原液可配成5-10mmol/L并分裝,-20貯存。一般反應(yīng)中每種dNTP的終濃度為20-200mol/L。理論上4 種 dNTP各20mol/L,足以在100l反應(yīng)中合成2.6g的DNA。當(dāng)dNTP終濃度大于50mmol/L時(shí)可抑制Taq DNA聚合酶的活性.4種dNTP的濃度應(yīng)該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現(xiàn)的錯誤摻入。 3. Mg2+：Mg2+濃度對Taq DNA聚合酶影響很大,它可影響酶的活性和真實(shí)性,影響引物退火和解鏈溫度, 影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+ 濃度范圍為0.5-2mmol/L.對于一種新的PCR反應(yīng),可以用0.1-5m

6、mol/L的遞增濃度的Mg2+ 進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn),選出最適的Mg2+濃度。在PCR反應(yīng)混合物中, 應(yīng)盡量減少有高濃度的帶負(fù)電荷的基團(tuán), 例如磷酸基團(tuán)或EDTA等可能影響Mg2+ 離子濃度的物質(zhì),以保證最適Mg2+ 濃度。4. 模板：PCR反應(yīng)必須以DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增, 模板DNA可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子,可以是線狀分子,也可以是環(huán)狀分子(線狀分子比環(huán)狀分子的擴(kuò)增效果稍好).就模板DNA而言,影響PCR的主要因素是模板的數(shù)量和純度.一般反應(yīng)中的模板數(shù)量為102 -105 個拷貝,對于單拷貝基因,這需要0.1g的人基因組DNA,10ng的酵母DNA,1ng的大腸桿菌DNA.擴(kuò)增多拷貝序列時(shí),

7、用量更少.靈敏的PCR可從一個細(xì)胞,一根頭發(fā),一個孢子或一個精子提取的DNA中分析目的序列.模板量過多則可能增加非特異性產(chǎn)物.DNA中的雜質(zhì)也會影響PCR的效率。5. Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期為92.5 130min,95 40min, 97 5min.現(xiàn)在人們又發(fā)現(xiàn)許多新的耐熱的DNA聚合酶,這些酶的活性在高溫下活性可維持更長時(shí)間.Taq DNA聚合酶的酶活性單位定義為74下,30min,摻入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量.Taq DNA聚合酶的一個致命弱點(diǎn)是它的出錯率,一般PCR中出錯率為2×10-4 核苷酸/每輪循環(huán),在利用PCR克

8、隆和進(jìn)行序列分析時(shí)尤應(yīng)注意.在100l PCR反應(yīng)中,1.5-2單位的Taq DNA聚合酶就足以進(jìn)行30輪循環(huán).所用的酶量可根據(jù)DNA、引物及其它因素的變化進(jìn)行適當(dāng)?shù)脑鰷p.酶量過多會使產(chǎn)物非特異性增加,過少則使產(chǎn)量降低.反應(yīng)結(jié)束后,如果需要利用這些產(chǎn)物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn),需要預(yù)先滅活Taq DNA聚合酶, 滅活Taq DNA聚合酶的方法有：(1) PCR產(chǎn)物經(jīng)酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。 (3) 99-100加熱10min.目前已有直接純化PCR產(chǎn)物的Kit可用。6. 反應(yīng)緩沖液：反應(yīng)緩沖液一般含10-50mmol/L Tris·Cl

9、(20下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和適當(dāng)濃度的Mg2+ . Tris·Cl在20時(shí)pH為8.3-8.8,但在實(shí)際PCR反應(yīng)中,pH為6.8-7.8. 50mmol/L的KCl有利于引物的退火.另外,反應(yīng)液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)或100g/ml的牛血清白蛋白(BSA),它們可穩(wěn)定酶活性,另外加入T4噬菌體的基因32蛋白則對擴(kuò)增較長的DNA片段有利.各種Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些緩沖液。二、PCR反應(yīng)參數(shù)1. 變性：在第一輪循環(huán)前,在94下變性5-10min非常重要,它可使模板DNA完全解鏈,然后加入Taq DNA聚合酶(hot

10、start),這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復(fù)合物所造成的錯誤。變性不完全,往往使PCR失敗,因?yàn)槲醋冃酝耆腄NA雙鏈會很快復(fù)性,減少DNA產(chǎn)量.一般變性溫度與時(shí)間為94 1min。在變性溫度下,雙鏈DNA解鏈只需幾秒鐘即可完全,所耗時(shí)間主要是為使反應(yīng)體系完全達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟?。對于富含GC的序列,可適當(dāng)提高變性溫度.但變性溫度過高或時(shí)間過長都會導(dǎo)致酶活性的損失。2. 退火：引物退火的溫度和所需時(shí)間的長短取決于引物的堿基組成，引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度.實(shí)際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的Tm值約低5。一般當(dāng)引物中GC含量高,長度長并與模板完全配對

11、時(shí), 應(yīng)提高退火溫度。退火溫度越高, 所得產(chǎn)物的特異性越高。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并,只用兩種溫度(例如用60和94)完成整個擴(kuò)增循環(huán), 既省時(shí)間又提高了特異性。退火一般僅需數(shù)秒鐘即可完成,反應(yīng)中所需時(shí)間主要是為使整個反應(yīng)體系達(dá)到合適的溫度。通常退火溫度和時(shí)間為37-55,1-2min。3. 延伸：延伸反應(yīng)通常為72,接近于Taq DNA聚合酶的最適反應(yīng)溫度75.實(shí)際上,引物延伸在退火時(shí)即已開始,因?yàn)門aq DNA聚合酶的作用溫度范圍可從20-85.延伸反應(yīng)時(shí)間的長短取決于目的序列的長度和濃度.在一般反應(yīng)體系中,Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成2kb長的DNA。延伸時(shí)間過長會導(dǎo)致產(chǎn)

12、物非特異性增加.但對很低濃度的目的序列, 則可適當(dāng)增加延伸反應(yīng)的時(shí)間。一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后,都需要一步較長時(shí)間(10-30min)的延伸反應(yīng),以獲得盡可能完整的產(chǎn)物, 這對以后進(jìn)行克隆或測序反應(yīng)尤為重要。 4. 循環(huán)次數(shù)： 當(dāng)其它參數(shù)確定之后, 循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA濃度。一般而言25-30輪循環(huán)已經(jīng)足夠。循環(huán)次數(shù)過多,會使PCR產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。通常經(jīng)25-30輪循環(huán)擴(kuò)增后, 反應(yīng)中Taq DNA聚合酶已經(jīng)不足, 如果此時(shí)產(chǎn)物量仍不夠, 需要進(jìn)一步擴(kuò)增, 可將擴(kuò)增的DNA樣品稀釋103-105倍作為模板, 重新加入各種反應(yīng)底物進(jìn)行擴(kuò)增, 這樣經(jīng)60輪循環(huán)后, 擴(kuò)增水平可達(dá)109-

13、1010 。擴(kuò)增產(chǎn)物的量還與擴(kuò)增效率有關(guān),擴(kuò)增產(chǎn)物的量可用下列公式表示:CC0 (1+P)n 。其中：C為擴(kuò)增產(chǎn)物量,C0 為起始DNA量, P為增效率, n為循環(huán)次數(shù)。 在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺效應(yīng)。平臺期會使原先由于錯配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺期前結(jié)束反應(yīng)，減少非特異性產(chǎn)物。 三、PCR產(chǎn)物的克隆 在許多研究中,需要將PCR產(chǎn)物克隆,以獲得目的DNA片段。此時(shí),所用PCR循環(huán)數(shù)應(yīng)盡量小,以減少平臺效應(yīng)或非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的干擾。通常將PCR產(chǎn)物插入到載體

14、中有下列一些方法。1. 平末端連接：由于Taq DNA聚合酶往往在PCR產(chǎn)物3'端加上多余的非模板依賴堿基,在用平末端連接克隆PCR產(chǎn)物前,可用Klenow片段或T4 DNA聚合酶處理補(bǔ)平末端。 2. 在PCR產(chǎn)物尾部加dT或ddT：Taq DNA聚合酶會在3'端加上多余的非模板依賴堿基,而且對A優(yōu)先聚合,所以PCR產(chǎn)物末端的多余堿基大部分都是A.。利用這一特點(diǎn),可以經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的平末端用酶加上dT或ddT,使載體與PCR產(chǎn)物末端互補(bǔ)并進(jìn)行連接.載體末端加dT尾可直接用Taq DNA聚合酶和dTTP或ddTTP,ddTTP因缺少3-OH而不能再形成磷酸二酯鍵,保證在載體3&

15、#39;端只加上一個ddTTP,而其5'端所含的磷酸基團(tuán)可與PCR產(chǎn)物的3'端OH連接,連接產(chǎn)物在載體和PCR產(chǎn)物之間的雙鏈上帶兩個切口,這種重組DNA仍可轉(zhuǎn)化合適的受體菌,并在細(xì)菌體內(nèi)修復(fù).目前一些公司已開發(fā)出可直接用于克隆PCR產(chǎn)物的帶3'-T的T-Vector。 3. 粘性末端連接：利用引物中附加在5'端的限制酶位點(diǎn),直接將PCR產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生粘性末端,與載體連接,產(chǎn)生重組DNA.如果下游兩個引物中含有兩個不同的限制酶位點(diǎn).經(jīng)酶切后定向克隆到載體中。 第二節(jié) 材料、設(shè)備及試劑 一、材料 不同來源的模板DNA。 二、設(shè)備 移液器及吸頭，硅烷化的

16、PCR小管，DNA擴(kuò)增儀(PE公司)，瓊脂糖凝膠電泳所需設(shè)備(電泳槽及電泳儀)，臺式高速離心機(jī)。 三、試劑： 1、10×PCR反應(yīng)緩沖液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25下, pH9.0, 1.0 Triton X-100。2、MgCl2 ：25mmol/L。 3、4種dNTP混合物:每種2.5mmol/L。 4、Taq DNA聚合酶5U/l。 5、T4 DNA連接酶及連接緩沖液：配方見第五章。 6、經(jīng)Sma酶切和加dT的pUC質(zhì)粒。 7、其它試劑：礦物油（石蠟油），1% 瓊脂糖，5×TBE，酚:氯仿:異戊醇(25:24:

17、1)，無水乙醇和70 乙醇。 第三節(jié)操作步驟 一、PCR反應(yīng) 1. 依次混勻下列試劑35l H2 O5l 10×PCR反應(yīng)緩沖液4l 25mmol/L MgCl2 4l 4種dNTP 0.5l 上游引物（引物） 0.5l 下游引物（引物）0.5l 模板DNA(約1ng) 混勻后離心5秒。2. 將混合物在94下加熱5分鐘后冰冷,迅速離心數(shù)秒, 使管壁上液滴沉至管底,加入Taq DNA聚合酶（0.5l約2.5U），混勻后稍離心,加入一滴礦物油覆蓋于反應(yīng)混合物上。3. 用94變性1分鐘，45退火1分鐘, 72延伸2分鐘, 循環(huán)35輪,進(jìn)行PCR。最后一輪循環(huán)結(jié)束后, 于72下保溫10分鐘，

18、使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分。 二、電泳 按第二章所述,取10l擴(kuò)增產(chǎn)物用1瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析,檢查反應(yīng)產(chǎn)物及長度。三、PCR產(chǎn)物的純化 擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物如利用T-Vector進(jìn)行克隆，可直接使用，如用平未端或粘性未端連接，往往需要將產(chǎn)物純化。 （一）酚/氯仿法 1.取反應(yīng)產(chǎn)物加100l TE.。 2.加等體積氯仿混勻后用微型離心機(jī)10000rpm離心15秒,用移液器將上層水相吸至新的小管中. 這樣抽提一次, 可除去覆蓋在表面的礦物油。 3.再用酚:氯仿:異戊醇抽提二次,每次回收上層水相。 4.在水相中加300l 95乙醇,置-20下30min沉淀。 5.在小離心機(jī)上10000rpm離心10min,

19、吸凈上清液。加入1ml 70乙醇,稍離后,吸凈上清液.重復(fù)洗滌沉淀2次。將沉淀溶于7ml ddH2O 中，待用。 （二）Wizard PCR DNA純化系統(tǒng) Wizard PCR DNA純化系統(tǒng)可以快速、有效、可靠地提取PCR擴(kuò)增液中的DNA，提純后的DNA可用于測序、標(biāo)記、克隆等。 該系統(tǒng)中含有的試劑和柱子可供50次PCR產(chǎn)物的純化，試劑包括：50ml Wizard PCR DNA純化樹脂 5ml 直接提取緩沖液 50支 Wizard微型柱 1、吸取PCR反應(yīng)液水相放于1.5ml eppendorf管中。 2、加100ml直接提取緩沖液，渦旋混勻。 3、加1ml PCR DNA純化樹脂，1分

20、鐘內(nèi)渦旋混合3次。4、取一次性注射器, 取出注塞,并使注射筒與Wizard微型柱連接,用移液槍將上述混合液加入注射筒中,并用注塞輕推,使混合物進(jìn)入微型柱。5、將注射器與微型柱分開,取出注塞, 再將注射筒與微型柱相連,加入2ml 80%異丙 醇，對微型柱進(jìn)行清洗。6、取出微型柱置于eppendorf管中,12000g離心20秒，以除去微型柱中的洗液。7、將微型柱放在一個新eppendorf管中，加50l TE或水，靜止1分鐘后，12000g離心20秒。8、丟棄微型柱，eppendorf管中的溶液即為純化DNA，存放于4或-20。注意 1、純化樹脂在使用前必須充分混勻。 2、PCR產(chǎn)物中礦物油應(yīng)盡量吸去，否則會影響提取DNA的 產(chǎn)量。四、載體加dT尾 1.將1g p