淀粉酶的研究進(jìn)展[文獻(xiàn)綜述]

1、畢業(yè)論文文獻(xiàn)綜述生物工程淀粉酶的研究進(jìn)展1. 淀粉酶簡介淀粉酶是催化淀粉、糖原轉(zhuǎn)化成葡萄糖、麥芽糖及其它低聚糖的一類酶的總稱，廣泛應(yīng)用于淀粉工業(yè)、食品工業(yè)、醫(yī)藥、紡織、洗滌劑、青貯飼料、微生態(tài)制劑以及釀酒等行業(yè)1 。淀粉酶是最早用于工業(yè)化生產(chǎn)的酶，迄今為止仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一2 。不同種類的淀粉酶水解淀粉會生成不同的產(chǎn)物。常見的淀粉酶可以分為以下幾種：0-淀粉酶（EC3.2.1.1）,也叫液化酶；3淀粉酶（EC321.2）;葡萄糖淀粉酶（EC3 , 2.1.3）,也叫丫-淀粉酶，簡稱糖化酶（縮寫 GA或G）:異淀粉酶（EC321.68）等3?！?淀粉酶能隨機(jī)地作用于淀粉的非還

2、原端，生成麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，所得產(chǎn)物的還原性末端葡萄糖單位碳原子為“構(gòu)型，同時該酶能使淀粉漿的粘度下降；伊淀粉酶是從淀粉的非還原性末端切下一分子的麥芽糖，其產(chǎn)物還原性末端葡萄糖單位碳原子為3構(gòu)型；葡萄糖淀粉酶是從底物非還原末端依次水解加，4糖昔鍵和分支的a-1, 6-糖昔鍵，生成葡萄糖。異淀粉酶是只水解糖原或支鏈淀粉分支點(diǎn)的f6糖昔鍵，切下側(cè)枝鏈5 。對淀粉酶的分類和作用機(jī)制研究較多，可按來源、產(chǎn)物的旋光度、作用機(jī)制等進(jìn)行分類。但近年隨著酶學(xué)性質(zhì)的研究的發(fā)展，對酶的作用機(jī)制、方式等研究不斷取得新成果，分類學(xué)問題出現(xiàn)許多難點(diǎn)。我國在食品方面研究和應(yīng)用的微生物酶估計(jì)有30多種6,其中

3、淀粉酶有 a-淀粉酶、伊淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、異淀粉酶、普魯蘭酶、環(huán)糊精生成酶等。2. 淀粉酶的生產(chǎn)2.1 淀粉酶的來源淀粉酶的來源很廣泛，可以來自于植物、動物以及微生物。大部分的淀粉酶存在于微生物中，微生物中主要的兩種淀粉酶為a-淀粉酶及葡糖淀粉酶，此外，主要存在于植物中的3淀粉酶也存在于少量微生物中。體淀粉酶可以從幾種細(xì)菌、真菌和酵母中分離獲得。但是，由于細(xì)菌淀粉酶具有幾個比較優(yōu)良的特性，因此，細(xì)菌淀粉酶用的比較多，特別是淀粉液化芽孢桿菌已用于工業(yè)化生產(chǎn) 5 。不像其他的淀粉酶，微生物僅產(chǎn)生少量的伊淀粉酶，有桿菌（假單抱桿菌和梭狀芽抱桿菌）等。葡糖淀粉酶具有多種來源，植物、動物及微生物，但

4、是，商業(yè)上所用的葡糖淀粉酶也是來源于 微生物，在所有微生物中，真菌是葡糖淀粉酶的主要來源。2.2 淀粉酶的生產(chǎn)淀粉酶的生產(chǎn)主要有兩種方法， 即液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵。 由于固態(tài)發(fā)酵具有經(jīng)濟(jì)上和工程上的優(yōu)點(diǎn)，因此人們常常采用這種方法生產(chǎn)淀粉酶。2.2.1 a-淀粉酶的生產(chǎn)桿菌是a-淀粉酶的最重要的來源而且可以用于酶的生產(chǎn)。解淀粉芽抱桿菌和地衣芽抱桿菌可以生產(chǎn)耐熱的a-淀粉酶，同時也可以進(jìn)行生產(chǎn)酶及淀粉的水解5。在乳清、玉米漿以及大豆粉的基礎(chǔ)上，開發(fā)了一些簡單而又便宜的培養(yǎng)基用于a-淀粉酶的生產(chǎn)，這種培養(yǎng)基也可以進(jìn)一步開發(fā)成為工業(yè)生產(chǎn)a-淀粉酶用的培養(yǎng)基。一些研究表明，不同的碳源會影響笫淀粉酶的產(chǎn)量，

5、乳糖、葡聚糖及可溶性淀粉有利于酶的產(chǎn)量的提高，當(dāng)使用葡萄糖時，酶的產(chǎn) 量非常高。溶氧率也是a-淀粉酶發(fā)酵生產(chǎn)時的一個重要的因素，高的溶氧率可以產(chǎn)生大量的酶。絲狀真菌是胞外酶的最大的生產(chǎn)者，因此，用這些菌來生產(chǎn)a-淀粉酶也引起人們的興趣，嗜熱真菌是a-淀粉酶最好的生產(chǎn)菌，調(diào)節(jié)其生長條件和培養(yǎng)基成分，可以使酶的產(chǎn)量增加。固定化細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也用于生淀粉酶的生產(chǎn)，用這種技術(shù)可以極大地提高酶的產(chǎn)量，如將地衣芽抱桿菌固定在膜上，生產(chǎn)的a-淀粉酶比游離細(xì)胞產(chǎn)量多176%。2.2.2 伊淀粉酶的生產(chǎn)如前所述，3淀粉酶主要來源于植物，因此用微生物生產(chǎn)3淀粉酶的工作不多?？梢援a(chǎn)生3淀粉酶的微生物有多黏芽孢桿菌、蠟

6、狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、假單胞菌等。人們用來自于木薯、玉米、土豆、小麥和小麥熬等的廢棄淀粉作為底物來生產(chǎn)伊淀粉酶，發(fā)現(xiàn)以木蘿和小麥款為底物的 3淀粉酶產(chǎn)量最高；還有人用固定化細(xì)胞的方法來生產(chǎn)伊淀粉酶，在所有的方法中，離子化的凝膠作用于伊淀粉酶的生產(chǎn)最有效。2.2.3 葡糖淀粉酶的生產(chǎn)用黑曲霉以固狀培養(yǎng)的方式生產(chǎn)葡糖淀粉酶已作了大量的工作，這些研究包括農(nóng)副業(yè)與工業(yè)的廢棄物如小麥麩、米糠等對黑曲霉生長和活性的影響，此外，這些物質(zhì)及濕度還明顯地影響酶的生產(chǎn)。一些細(xì)菌和酵母也可以生產(chǎn)葡糖淀粉酶。發(fā)酵罐的設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)也影響酶的生產(chǎn)，如栽培木箱36 小時所產(chǎn)生的酶的量相當(dāng)于搖瓶培養(yǎng) 96小時所產(chǎn)生的酶的量

7、。此外，培養(yǎng)方法不同酶的產(chǎn)量也不一樣，如分批培養(yǎng)比一次投料的效果更好。2.3 淀粉酶的純化和性質(zhì)運(yùn)用于醫(yī)藥和治療的淀粉酶需要更高的純度，因此，開發(fā)出一種經(jīng)濟(jì)有效的方法對酶進(jìn)行純化從而獲得具有活性的化學(xué)純的酶是非常重要的。傳統(tǒng)上， 對發(fā)酵罐中的淀粉酶的純化分為幾個步驟：培養(yǎng)物的離心、用超濾法獲得選擇一定濃度的上清液、用硫酸銨或有機(jī)溶劑如冷乙醇獲得沉淀中的酶、粗制的酶用色譜法和膠過濾純化。細(xì)菌的a-淀粉酶可以從桿菌中獲得，人們已經(jīng)研究了喜溫菌株和耐熱菌株的純化和特性。一些 研究者用硫酸鏤沉淀、離子交換色譜和膠過濾法純化獲得了同質(zhì)的笫淀粉酶，焦碳酸二乙酯可以抑制此酶的活性。由地衣芽抱桿菌生產(chǎn)的細(xì)胞外

8、耐熱型a-淀粉酶可以用下面的方法純化：在乙二醇/葡聚糖系統(tǒng)中做兩層分離，然后用膠過濾和離子交換色譜進(jìn)行純化 7,8,9 。細(xì)胞外淀粉酶的基本性質(zhì)反映了細(xì)菌所生長環(huán)境的酸堿度和溫度， 如某些堿性桿菌生長于 50， pH為10.5,其產(chǎn)生的a-淀粉酶的最適溫度和 pH分別為60c和pH值11.012.0;另一類桿菌生長 的最適pH為8.5,所產(chǎn)的a-淀粉酶最適pH為9.0。在工業(yè)化的生產(chǎn)中，人們常常用自動聚焦的純化技術(shù)獲得化學(xué)純的淀粉酶，這種方法可以純化一些枯草芽抱桿菌產(chǎn)生的a-淀粉酶。此法可以采用大量的起始反應(yīng)物，可以大量生產(chǎn)a-淀粉酶。在真菌中，獲得純化的a-淀粉酶僅有很少的一些菌株，因此它們

9、的性質(zhì)研究也不多。不同的菌株所產(chǎn)的a-淀粉酶性質(zhì)不一樣10。酵母的a-淀粉酶獲得純化的酵母a-淀粉酶也不多，從隱球酵母生產(chǎn)的可以消化生淀粉的耐熱0-淀粉酶的純化僅用一步方法便可以解決，這種酶與黑曲霉和米曲霉產(chǎn)生的a-淀粉酶性質(zhì)相似11。從微生物中獲得的3淀粉酶比從植物中獲得的伊淀粉酶具有更高的耐熱性，伊淀粉酶與a-淀粉酶相比，其最適的pH更高，而且不需要 Ca2+作為酶的穩(wěn)定劑和提高酶的活性，用硫酸分級分離， 離子交換色譜和膠過濾的方法純化。Hg2+、Zn2+和Cu2+可以抑制酶的活性，Na +可以激活酶。加入支鏈淀粉酶可以極大地提高酶對生淀粉的降解。此外，麥芽糖是伊淀粉酶運(yùn)用于生谷物淀粉的水

10、解產(chǎn)物。許多菌株產(chǎn)生的葡糖淀粉酶已獲得純化，性質(zhì)也獲得了確定?？偟膩碚f，葡糖淀粉酶的最適pH為4.55.0,最適溫度為4060C,但也有一些例外，有些酶的最適pH值可達(dá)11.0。商業(yè)上從黑曲霉中獲得的葡糖淀粉酶制備物中包含有六種類型，其分子大小明顯不同，最適的pH值在3.55.0之間。通過純化根霉產(chǎn)生的葡糖淀粉酶，可以獲得兩種葡糖淀粉酶，一種酶具有強(qiáng) 的脫支鏈的活性，另一種酶脫支鏈的能力較強(qiáng)。此外，還有對生淀粉的吸收和消化能力都特別強(qiáng)。3. 淀粉酶的研究進(jìn)展淀粉酶中，尤以生淀粉酶最為常用，隨著社會需求的增大，工業(yè)生產(chǎn)對口-淀粉酶的需求量越來越大。3.1 -淀粉酶的催化機(jī)理目前公認(rèn)的笫淀粉酶的催

11、化機(jī)理12,13,催化中心位于 a /桶狀結(jié)構(gòu)的底部，261位谷氨酸和231位天冬氨酸是起催化作用的兩個重要?dú)埢?。整個催化過程可分三步：第一步，淀粉鏈中的糖苷氧被質(zhì)子供體261谷氨酸質(zhì)子化；第二步，親核基團(tuán)231位天冬氨酸親核攻擊葡萄糖殘基的C1,糖昔鍵斷裂，葡萄糖殘基與231 位天冬氨酸形成酯鍵，同時去質(zhì)子化狀態(tài)的 261 位谷氨酸奪取一個水分子H + ,產(chǎn)生一個 OH-；第三步，OH-攻擊葡萄糖殘基的 C1,使酯鍵斷裂，261位谷氨酸和231位天冬氨酸重新恢復(fù)初始狀態(tài)。在已知結(jié)構(gòu)的a-淀粉酶中，在 “/桶狀結(jié)構(gòu)的底部，均含有谷氨酸和天冬氨酸兩個殘基，它們的相對位置相似，并且所有華淀粉酶的整

12、體三維結(jié)構(gòu)都很相似，因此，它們的催化反應(yīng)機(jī)理應(yīng)該是相同或相近的 13。以對a-淀粉酶分子結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理的研究為基礎(chǔ)，通過各種手段改善酶的催化反應(yīng)特異性，使其更適合于在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用是近年來新興的發(fā)展趨勢。3.2 %淀粉酶的突變研究目前應(yīng)用得最廣泛的基因水平上的突變主要有兩種，即隨機(jī)突變和定點(diǎn)突變，有時也將兩種方法結(jié)合使用。隨機(jī)突變首先需構(gòu)建突變文庫，然后根據(jù)研究酶的特點(diǎn)設(shè)計(jì)高通量的篩選方法。它的優(yōu)點(diǎn)是不必明確知道酶的三維結(jié)構(gòu)、催化機(jī)理等。定點(diǎn)突變需要對酶的結(jié)構(gòu)機(jī)理有較明確的認(rèn)識，它更適用于研究單個或多個位點(diǎn)對酶分子的影響。將這些方法應(yīng)用于a-淀粉酶的研究已有一定進(jìn)展。目前有關(guān)突變的研究大多針對

13、于地衣芽胞桿菌活菌，如 Takase 研究發(fā)現(xiàn)天冬酰胺 326 賴氨酸 / 天冬氨酸能夠顯著改變地衣芽胞桿菌活菌的 pH 特性 14 。 Nielsen J E 等對地衣芽胞桿菌活菌進(jìn)行定點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺264 絲氨酸和天冬酰胺190 苯丙氨酸能提高地衣芽胞桿菌活菌的熱穩(wěn)定性。 ShawA 等15通過隨機(jī)突變， 得到 Met15Thr ， 能增強(qiáng)地衣芽胞桿菌活菌的穩(wěn)定性， 在此突變的基礎(chǔ)上進(jìn)行隨機(jī)突變， 發(fā)現(xiàn) Met15Thr 和天冬酰胺 188絲氨酸使地衣芽胞桿菌活菌熱穩(wěn)定性提高2 倍16。 但目前就氨基酸突變?nèi)绾螌?dǎo)致酶宏觀性質(zhì)的改變有待進(jìn)一步研究。3.3 基因克隆及氨基酸序列分子生物技

14、術(shù)的發(fā)展，對a-淀粉酶的研究已進(jìn)入分子水平階段，在華淀粉酶的氨基酸序列分析、基因編碼及核苷酸序列分析、基因克隆和基因性狀表達(dá)等方面都取得較大的進(jìn)展，基因工程技術(shù)已廣泛應(yīng)用到了淀粉酶生產(chǎn)菌株的克隆上，并且在不同微生物的a-淀粉酶基因克隆方面已經(jīng)作了大量的工作，主要在大腸桿菌等。Suganum a等 研究了 華淀粉酶的N-端氨基酸序列。Kim等 描述了編 碼一種新”-淀粉酶的基因，該基因被克隆并在大腸桿菌中表達(dá)17。Steyn和Pretorius編碼”-淀粉酶基因(AMY)編碼GA的基因(STA 2)轉(zhuǎn)入一個酵母菌的整合載體 (Yip5) ，形成重組質(zhì)粒 pSP1 和 pSP2， AMY 和 ST

15、A 2 被一同連接到載體Yip5 中，產(chǎn)生質(zhì)粒pSP3。隨后，編碼抗Geneticin 418顯性標(biāo)記的 A PH 1被克隆到pSP3中得到pSP4。為了增強(qiáng)Geneticin 418 的表達(dá)，pSP4再連接啟動子 GAL10和終止子URA3 ,這樣就得到質(zhì)粒 pSP5。pSP5通過增力口 ARS1H 和CEN4序列被修改成環(huán)形微染色體pSP6。轉(zhuǎn)入了 pSP1-pSP6的實(shí)驗(yàn)室郎酒酵母菌株能穩(wěn)定產(chǎn)多種a-淀粉酶和GA 18。4. 結(jié)論淀粉酶是工業(yè)中最重要的酶，淀粉酶具有很多來源，但是微生物來源的淀粉酶，特別是a-淀粉酶和葡糖淀粉酶，在商業(yè)上發(fā)揮著重要的作用。由于淀粉是可以由淀粉酶水解的天然物

16、質(zhì)，分離有效的微生物菌株生產(chǎn)對生淀粉有效性高的淀粉酶是非常理想的。應(yīng)用新的耐熱性葡糖淀粉酶可以促進(jìn)淀粉的水解過程，而使用a-淀粉酶可以使整個過程一步便可以完成，具有經(jīng)濟(jì)效益。現(xiàn)在，必須開發(fā)具有雙重功效的，如液化作用和糖化作用的微生物菌株如淀粉分解酵母。也應(yīng)該開發(fā)具有有效伊淀粉酶活性的菌株，伊淀粉酶可以用來生產(chǎn)麥芽糖漿?？梢杂棉r(nóng)業(yè)和工業(yè)上的廢物作為淀粉酶生產(chǎn)的底物，從而降低開支，也解決了廢物的處理和污染問題。另外，將淀粉酶的應(yīng)用范圍拓寬如應(yīng)用于生物制藥領(lǐng)域也具有積極的意義。參考文獻(xiàn)1孫曉菲，李愛江.-淀粉酶的應(yīng)用及研究現(xiàn)狀.J.畜牧獸醫(yī)科技信息，2008(6):13-14.2 張雙民.土壤中淀粉

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