VP-A-010-00紅霉素中二氯甲烷殘留檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案0112要點(diǎn)

1、編號(hào)：VP-A-012-00版本號(hào)：00紅霉素中二氯甲烷和三氯甲烷殘留檢驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)告紅霉素中二氯甲烷和三氯甲烷殘留檢驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)告Validation Report of Methylene Chloride and Chloroform ResidueTestMethod in Erythromycin驗(yàn)證方案編號(hào)：VP-A-012-00版本號(hào)：00目 錄1. 概述21.1產(chǎn)品概述2.1.1.1產(chǎn)品名稱21.1.2產(chǎn)品化學(xué)結(jié)構(gòu)式 21.2方法建立概述 2.2. 檢測(cè)方法32.1溶劑殘留接受標(biāo)準(zhǔn) 3.2.2方法描述3.2.2.1 儀器32.2.2 試劑32.2.3溶液配制32.2.4色譜條件

2、 32.2.5系統(tǒng)適應(yīng)性42.2.6計(jì)算43驗(yàn)證內(nèi)容53.1試劑及儀器5.A. 檢測(cè)用試劑5B. 樣品5C. 儀器和設(shè)備53.2驗(yàn)證溶液配制 5.3.3 操作6.3.4驗(yàn)證項(xiàng)目6.3.4.1 精密度 63.4.2 .線性83.4.3回收率83.4.4定量限、檢測(cè)限 93.4.5.耐用性 104.驗(yàn)證結(jié)果評(píng)定與結(jié)論 11121.概述1.1產(chǎn)品概述1.1.1產(chǎn)品名稱中文名：紅霉素英文名：ERYTHROMYCIN1.1.2產(chǎn)品化學(xué)結(jié)構(gòu)式分子式：C37H67NO13結(jié)構(gòu)式：ErythromycinMol. Formula叫R1R2A6 了出刑0詣734OHch3BC37H67NO12718Hch3CC

3、36H55NO13720OHH1.2方法建立概述我公司生產(chǎn)的紅霉素在生產(chǎn)過程中使用了二氯甲烷，該溶劑的測(cè)定方法按照 VP-A-004-00進(jìn)行了驗(yàn)證，但是由于使用了 FID檢測(cè)器，對(duì)二氯甲烷的靈敏度不高，因此 驗(yàn)證結(jié)并不是很理想，特別是當(dāng)二氯甲烷的濃度較低時(shí)，準(zhǔn)確度難以保證，該方法使用電子捕獲檢測(cè)器（ECD對(duì)二氯甲烷的檢測(cè)重新驗(yàn)證。試劑二氯甲烷中含有少量三氯甲烷， 因此同時(shí)對(duì)三氯甲烷也需要檢測(cè)監(jiān)控。色譜系統(tǒng)和條件參照美國藥典（USP 467專論和歐洲藥典（Ph.Eur）2.4.24專論。2.檢測(cè)方法2.1溶劑殘留接受標(biāo)準(zhǔn)溶劑二氯甲烷三氯甲烷限度600ppm60ppm2.2方法描述2.2.1儀器

4、萬分之一分析天平 Agile nt6890N GC with 7694E Headspace2.2.2試劑DMSO（HPLC）二氯甲烷（AR）;三氯甲烷（AR2.2.3溶液配制樣品溶液：取樣品約0.50g，精密稱定，用DMS溶解，并稀釋至50ml;溶劑溶液：取二氯甲烷約3.0g，三氯甲烷約0.3g，精密稱定，用DMSOS解，并稀釋至100ml，精密量取1.0ml，用水稀釋至100ml,精密量取1.0ml，用水稀釋至10ml?？瞻兹芤海喊凑杖軇┤芤旱呐渲品椒ㄅ渲瓶瞻兹芤?，但是沒有二氯甲烷和三氯甲烷。供試液：精密量取5.0ml樣品溶液+1.0ml空白溶液于20ml頂空瓶中；（三樣）對(duì)照液A:精密量

5、取5.0ml樣品溶液+1.0ml溶劑溶液于20ml頂空瓶中；（三樣） 對(duì)照液B:精密量取5.0ml DMSO +1.0ml空白溶液于20ml頂空瓶中.2.2.4色譜條件色譜柱：DB624 30mX 0.32mnrK 1.8um載氣：氮?dú)?；流速?5cm/s ;頂空溫度：樣品瓶溫105C ；定量環(huán)溫110C ;傳輸線溫110C；進(jìn)樣條件：加熱平衡45min，樣品瓶加壓0.5min，定量環(huán)充樣0.03min，定量環(huán)平衡0.2min，進(jìn)樣 1.0min ；爐溫：40E保持15min,以20C/min的速度升溫至240E，保持2min；檢測(cè)器：ECD溫度250E，進(jìn)樣口溫度140C。操作進(jìn)樣對(duì)照液B；

6、進(jìn)樣對(duì)照液A；進(jìn)樣供試液。2.2.5系統(tǒng)適應(yīng)性對(duì)照液A三針的RSD不大于10%2.2.6計(jì)算CH2CL2A Mr 100(AR - AT) M TppmCHCL3At M r 100(Ar -At) MtPPm其中：Ar為供試液平均峰面積；AR為對(duì)照液平均峰面積；M為對(duì)照液二氯甲烷或三氯甲烷的稱樣量;m為樣品的稱樣量。3驗(yàn)證內(nèi)容3.1試劑及儀器A 檢測(cè)用試劑試劑名稱批號(hào)廠家等級(jí)DMSO408168美國天地公司HPLC二氯甲烷20040325國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司AR三氯甲烷0603092廣東汕頭市西隴化工廠ARB樣品樣品名稱紅霉素/批號(hào)ERY2-200707001/C 儀器和設(shè)備儀器名稱型號(hào)

7、數(shù)量校正有效期至氣相色譜儀6890N12009年5月17日自動(dòng)頂空進(jìn)樣器7694E12009年5月17日3.2驗(yàn)證溶液配制樣品溶液配制：取樣品約2.5g，精密稱定，用DMS溶解并稀釋至250ml。對(duì)照儲(chǔ)備液：取二氯甲烷約 3.0g，三氯甲烷約0.3g，精密稱定，用DMS（溶解并稀釋 至100ml，精密量取1.0ml， 用水稀釋至100ml。 各濃度對(duì)照液：分別取對(duì)照儲(chǔ)備液 1.0ml，2.0ml，4.0ml，5.0ml和7.5ml于5個(gè)50ml 容量瓶中，用水稀釋至刻度。配制成 20% 40% 80% 100唏口 150%勺對(duì)照液?？瞻兹芤海喊凑諏?duì)照液的配制方法配制空白溶液，但是沒有二氯甲烷和

8、三氯甲烷。0%溶液：精密量取5.0ml樣品溶液+1.0ml空白溶液于20ml頂空瓶中（平行三樣）；20%-150%羊品溶液：精密量取5.0ml樣品溶液+1.0ml對(duì)應(yīng)濃度對(duì)照液于20ml頂空瓶中（平行三樣）；100%對(duì)照溶液：精密量取 5.0ml DMSO +1.0ml對(duì)應(yīng)濃度對(duì)照液（100%）于20ml頂空瓶 中（平行六樣）。3.3操作按照0%、20%、40%、80%、100%、150%樣品溶液、100%對(duì)照的順序進(jìn)樣，記錄各 樣的峰面積，結(jié)果見表1。（以下記錄峰面積均為扣除空白后面積）表1溶液0%20%40%80%100%150%100%對(duì)照二氯甲烷55.4373.6719.41221.2

9、1516.12159.51615.01536.651.5383.6713.11233.91480.52099.61535.51546.556.0390.6736.01178.41450.02011.61516.21545.8平均值54.3382.6722.81211.21482.22090.21549.3RSD4.5%2.2%1.6%2.4%2.2%3.6%2.2%三氯甲烷372.01329.42634.44841.56295.39615.56536.66326.9332.51357.72603.44905.56144.99277.76271.76359.5363.81415.52707.44

10、724.56039.58909.26184.36296.2平均值256.11367.62648.44823.86159.99267.56329.2RSD5.8%3.2%2.0%1.9%2.1%3.8%1.9%操作人/日期：3.4驗(yàn)證項(xiàng)目3.4.1.精密度1 系統(tǒng)精密度計(jì)算40%、80%、150%樣品溶液各自三針的RSD，查看系統(tǒng)精密度（具體數(shù)據(jù)參見表1）,結(jié)果見表2。表2溶液濃度40%80%150%二氯甲烷RSD1.6%2.4%3.6%三氯甲烷RSD2.0%1.9%3.8%2 方法精密度計(jì)算100%對(duì)照液6針的RSD,查看方法精密度，結(jié)果見表 3表3測(cè)定次數(shù)123456RSD二氯甲烷面積161

11、5.01536.61535.51546.51516.21545.82.2%三氯甲烷面積6536.66326.96271.76359.56184.36296.21.9%結(jié)論：該方法精密度良好，RSD均小于3.0%，能滿足分析要求。操作者/日期：3中間精密度按照3.3.2配制溶液40% （三份）、80% （三份）、和150% （三份），100%寸照溶液（六 份），在另一天由另一 QC員進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。計(jì)算中間精密度，結(jié)果見表 4、表5。表4溶液濃度40%RSD80%RSD150%RSD二氯甲烷482.54.5%998.61.5%1621.72.0%477.41028.91583.3444.11011.6

12、1647.2三氯甲烷1951.53.6%4298.51.9%7371.92.2%1981.94464.97197.71850.14366.47523.3結(jié)論：中間精密度良好，RSD均小于5.0%，表明方法重現(xiàn)性較好操作者/日期：表5測(cè)定次數(shù)123456RSD二氯甲烷面積1290.01264.41216.01211.71226.21201.92.8%三氯甲烷面積6046.95560.45353.25309.25384.35366.85.1%結(jié)論：結(jié)果表明儀器精密度良好， 操作者/日期：RSD 小于 10.0%。3.4.2.線性把20%、40%、80%、100%, 150%樣品溶液的峰面積平均值分

13、別減去溶液0%的平均值，以溶液中二氯甲烷和三氯甲烷的濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行二元線性回 歸，計(jì)算方法的線性和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表 6。表6溶液濃度0%20%40%80%100%150%二氯甲烷峰面積54.3382.6722.81211.21482.22090.2調(diào)整面積/328.3668.51156.81427.92035.9三氯甲烷峰面積256.11367.62648.44823.86159.99267.5調(diào)整面積/1059.52351.34368.45683.48553.1二氯甲烷線性公式：y=43.215x + 112.26r2=0.9976三氯甲烷線性公式：y=1957.5x

14、 52.095r2=0.99962要求：r 0.98結(jié)論：線性關(guān)系良好，線性范圍分別為：二氯甲烷119891ppm,三氯甲烷1287ppm。 操作者/日期：3.4.3回收率把樣品溶液20%、40%、80%、100% 150%的峰面積平均值分別減去溶液 0%的平均值, 再除以對(duì)照100%的平均值，分別乘以5、2.5、1.25、1.0、0.667。以考察各個(gè)濃度下方法 的回收率?；厥章蕬?yīng)在80%-120%之間，結(jié)果見表7。溶液濃度0%20%二氯甲烷峰面積54.3382.6調(diào)整峰面積/328.3回收率/106%三氯甲烷峰面積256.11367.6調(diào)整峰面積/1059.5回收率/84%結(jié)論：二氯甲烷及

15、三氯甲烷回收率均在 80%1 收率為97%，說明用該方法進(jìn)行測(cè)定，準(zhǔn)確度- 但仍能滿足分析要求。操作者/日期：40%80%100%150%722.81211.21482.22090.2668.51156.81427.92035.9108%93%92%88%2648.44823.86159.99267.52351.34368.45683.48553.193%86%90%90%20%之間，符合回收率要求。二氯甲烷平均回 高；三氯甲烷平均回收率為89%，略偏低，3.4.4定量限、檢測(cè)限把對(duì)照100卿DMS不斷稀釋，計(jì)算待測(cè)信號(hào)的信噪比，以確定 待測(cè)溶劑的檢測(cè)限和 定量限，以及他們?cè)跇悠分械暮肯薅龋?/p>

16、結(jié)果見表 &表8檢測(cè)限定量限S/N濃度(ug/ml)樣品中殘留量S/N濃度(ug/ml)樣品中殘留量二氯甲烷2.90.36ppm11.9120ppm三氯甲烷3.80.010.3ppm11.70.031ppm結(jié)論：由上述實(shí)驗(yàn)可以看出，使用 ECD檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度高，響應(yīng)值大。二氯甲烷 檢測(cè)限為6ppm，疋量限為20ppm；三氯甲烷檢測(cè)限為 0.3ppm,疋量限為1ppm。 操作者/日期：3.4.5.耐用性用對(duì)照100%S液來考察方法的耐用性，僅進(jìn)行單因素條件試驗(yàn)，不進(jìn)行正交試驗(yàn)（即 只改變某一個(gè)條件，其它條件不變），以二氯甲烷及三氯甲烷的峰面積為考查對(duì)象，計(jì)算 RSD結(jié)果見表9。方面包括如

17、下：1）頂空瓶平衡時(shí)間考查 40min、45min、50min ；2）色譜柱初始溫度考查 42C、40C、38C3 ）載氣流速 35cm/s、38cm/s、32cm/s表9123二氯甲烷三氯甲烷RTAreaRSDRTAreaRSD4540354.6811104.41.0%8.5763997.31.2%4538354.8721082.69.0923902.34542354.4601097.68.0213942.44040354.6571285.52.9%8.5354542.22.9%4540354.6561266.48.5324494.65040354.6581214.18.5374295.34540384.3131207.16.5%7.8884421.18.1%4540354.6811104.48.5763997.34540325.1311064.89.4133772.2結(jié)論：通過上述試驗(yàn)可以看出，頂空平衡時(shí)間及色譜柱初始溫度的微小改變對(duì)結(jié)果基本上無 影響，其RSD勻小于3.0%;流速的改變對(duì)結(jié)果影響較大， RSD大于5.0%。操作者/日期：編號(hào)：VP-A-012-00版本號(hào)：00紅霉素中二氯甲烷和三氯甲烷殘