醫(yī)藥PI染色檢測細胞周期PROTOCOL共3

1、【醫(yī)藥】PI染色檢測細胞周期 PROTOCOL共3頁）PI染色檢測細胞周期protocol1、離心收集細胞，棄上清，用預冷 PBS洗細胞兩次。2、加入預冷70聽醇，于4?固定過夜，或-20?長期固定（4?過夜一般隔天就進 行檢測，如果想推遲幾天測，那就保存在-20?，有資料說-20?可以保存一個月，個 人建議盡量在最短時間內檢測，有些實驗是在不同時間點上收細胞，這時我就等最后一次固定完了一塊測，基本上也多在一周內檢測完畢，沒有特地去比較保存時間 對檢測結果的影響）。3、細胞染色離心收集細胞，以1mL的PBS洗細胞一次，加入 500uLPBS含50ug/mL溴化乙 錠（PI），100ug/mL

2、RNase A, 0.2% Triton X-100）4? 避光孵育 30 分鐘（PI 我是直 接用PBS配成工作濃度，然后加入細胞沉淀混勻， RNA酶現(xiàn)加，但有時不加發(fā)現(xiàn)對 實驗結果也沒太大的影響）。4、流式分析以標準程序用流式細胞儀檢測，一般計數(shù) 2-3萬個細胞，結果用細胞周期擬和軟件ModFit分析。分析時，使用FL2-W和FL2-A顯示，去除聯(lián)體細胞，具體如下圖。- - 9 - - - - k - - kLZ-'RV細胞周期流式后一般分為 G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在 G0/G1期 前面有個凋亡峰（也稱sub-G0期）,而如果分析時細胞窗口沒設置好，可能在最

3、前面t t it T 廠丁 - 11t nr社和*畀申L甘-占LSOftFlf P2 « 02T還有細胞碎片峰fwrs ”T：i畀 a?4 EFJfi財 J IS 皿了 TVi，1 rv,- f “嚇OiDl>d 1 0£ CK? TDIG M Z9X*r JS 7C DI 諒：13.0? *41 9! 4S 釧.豈：5 5i&t*L.ls >PIWH：芒.殆戈 伽 |i*D 0 I? W吋 fl. 413 S "t J”-3 1心 % lF"T“rnW If, a i ev>*er- i m耳i 嚴 |c T "&#

4、39; h Ki C F± nN I £ - 3 KS l.*O>結果解讀G0/G1期細胞占總的61.2%,峰位于橫座標的45.76G2/M期占13.07，峰位于橫座標的91.43S期占25.73G2/G1為2.0（即G2期為4倍體細胞，而G1期為2倍體細胞，比值為2）峰的變異系數(shù)為4.54%（好）細胞碎片為0.48%,細胞聚集體有0.06%。總的細胞數(shù)（儀器檢測到的）為17525個，在細胞周期中分析的細胞數(shù)為17431個（即排除了碎片及聚集體后）CV是變異系數(shù)。一般CVK小，峰形越好，越尖銳。能控制在5流右是比較好的結果，一般小于10%t可以認可了。Flow Cyt

5、ometric Analysis of Cell Cycle Fixation61) Collect 2 x 10 cells.2) Pellet cells by spinning at 1,000 rpm, 4?C for 5 minutes.3) Resuspend cell pellet in 1 ml of cold PBS. 4) Fix cells by adding4 ml of -20?C absolute ethanol. 5) Store cells at -20?C in this fixationbuffer until ready for analysis. (No

6、more than 2 weeks)Staining6) Centrifuge (as above) fixed cells and resuspend pellet in 1 ml ofPBS.7) Add 100 卩 l of 200 卩 g/ml DNas-eree, RNaseA and incubate at 37?C for 30 minutes.8) Add 100 卩 l of 1 mg/ml propidium iodide (light sensitive) and incubateat room temperature for 5-10 minutes.9) Place

7、samples in 12 X 75 Falcon tubes and read on BectonDickinsonFACStarPLUS.PI 染液配制(100ml):PI 5mg、RNase 2mg 1.0%Triton X-100 0.25ml 、生理鹽 水 65ml、枸櫞酸納100mg加蒸餾水至100ml，調pH值7.2-7.6，用棕色瓶子分裝，4? 避光保存。注意事項 :1 在細胞固定時一定要將細胞吹開，吹成單細胞 ;2 固定液 :70%酒精 要在-20 預冷 ;3 細胞要選用活力高的。流式細胞 PI 單染中為什么用 RNAse,在測細胞周期時，因為已經在細胞膜打孔了，PI很容易透

8、過細胞膜和DNA吉合，但 RNA也是核酸，也會被染色，為避免干擾染色前需用RNAse筆解RNA。這樣PI只染 DNA，能精確以熒光強度反映DNA勺含量。做流式細胞時， PI 染色， PI 的濃度應該是多少 ?還有就是 400 目的篩網是什么 100ug/ml ，一般用 400目勺篩網是用來將粘在一起勺細胞團濾掉勺，否則會出 現(xiàn)人為勺多倍體干擾，分析勺時候需要勺是單個勺細胞，不過如果經驗豐富也 可以 gate 掉勺。如果你沒有條件，建議在染色之前將細胞彈勺很散，再進行染色PI 勺配置deardeer:PI 怎樣配制, 怎樣保存 , 有勺文獻說要用檸檬酸鈉溶解，這對實驗有 影響嗎, 如果不這樣，那

9、直接加入而不用檸檬酸鈉溶解可以嗎 ,an dywa ng:我用來做流式的 PI配制方法是：5mg PI +0.1ml Trit on X-100 +3.7mg EDTA +10ml PBS,4度避光保存。為儲存液，用時稀釋 10倍。任脈 任脈二四會陰曲，中極關元石門居，氣海陰交入神闋，水分下脘連建里，中脘 上脘巨闋平，鳩尾中庭膻中行，玉堂紫宮連華蓋，璇璣天突廉泉承。督脈督脈二八起長強，腰俞陽關命門當，懸(L1)脊中(T11)連中樞(T10)，筋縮(T9) 至陽靈臺 (T6)上，神道（T5）身柱（T3）陶道（T1）行，大椎啞門風府中，腦戶強間上后頂，百會 前頂囟會從，上星神庭素髎過，水溝兌端齦交

10、中。肺經肺經十一中府云，天府 （下3）俠白（下4）尺澤深，孔最 （上7）列缺經渠涉，太淵 魚際少商尋。 心經心經穴位九穴真，極泉青靈 （上3）少海深，靈道通里陰郄至，神門少府少沖尋。 心包經心包經計九穴整，天池天泉 （ 下 2） 曲澤行，郄門間使內關入，大陵勞宮及中沖。 大腸經大腸二十起商陽，二間三間合谷旁，陽溪偏歷 （上3）溫溜（上 5）過，下廉上廉 三里上，曲池肘髎手五里，臂臑肩髃巨骨當，天鼎扶突禾髎香。小腸經小腸經計十九整，少澤前谷后溪行，腕骨陽谷可養(yǎng)老，支正（上5）小海過肩貞，臑俞天宗及秉風，曲垣肩外俞（T1旁3）肩中（C7旁2）,天窗天容上顴醪,最后一 穴是聽宮。 三焦經三焦穴位二十

11、三，關沖液門中渚滿，陽池外關支溝配，會宗三陽（上4）四瀆（下5）連，天井續(xù)接清冷淵 （天井上 1），消濼臑會 （肩髎下 3）肩髎懸，天髎 （肩井連曲垣 中點）天牖起翳風，瘛脈顱息角孫同，耳門和髎絲竹空。胃經胃經穴位四五整，承泣四白巨髎經，地倉大迎下頰車，下關頭維過人迎，水突 氣舍下缺盆，氣戶庫房屋翳深，膺窗乳中連乳根，不容承滿及梁門，關門太乙滑肉 門，天樞外陵大巨輪，水道歸來連氣沖，髀關伏兔陰市中，梁丘犢鼻足三里，上巨 條口下巨豐，解溪沖陽陷谷旁，內庭厲兌經穴終。膀胱經膀胱六七起睛明，攢竹眉沖曲差 （上 0.5 旁 1.5） 行，五處（上 1）承光（上2.5） 上 通天（上4），絡卻（上5.5

12、）玉枕（后上2.5旁1.3）天柱（旁1.3）擎，大杼（T1旁1.5） 風門肺俞連，厥陰心督膈肝膽，脾胃三焦腎氣海，大腸關元小腸懸，膀胱中膐白環(huán) 繞，上髎次髎中下髎，會陽承扶殷門 （下 6）過，浮郄委陽委中高。 附分魄戶膏肓 輸，神堂譩僖膈關入 , 魂門陽綱過意舍，胃倉肓門志室住，胞肓秩邊連合陽，承筋 （下 5）承山及飛揚，跗陽 （上 3）昆侖仆參居，申脈金門京骨束，通骨至陰經穴已。膽經 膽經四四瞳子髎，聽會上關頷厭好，懸顱懸厘連曲鬢，率谷天沖浮白繞，竅陰 完骨本神 （上 0.5 旁 3）妙，陽白臨泣 （上 0.5 旁 2.25） 目窗（上 1.5） 高，正營（上 2.5） 承靈（上 4）連腦空

13、（后上 2.5） ，風池肩井淵液 （腋下 3 肋 4）中，輒筋 （淵液前 1）日月 （肋 7旁 4）京門當，帶脈五樞維道行，居髎環(huán)跳過風市，中瀆 （上 5）陽關陽陵交 （上 7），外丘（上 7）光明陽輔高，懸鐘丘墟足臨泣，地五俠溪竅陰了。脾經脾經穴位二十一，隱白大都太白抵，公孫 （一跖骨基底節(jié)前下 ）商丘三陰交，漏 谷（踝尖連陰陵，上 6）地機（踝尖連陰陵，下 3）陰陵系，血?；T （血海上 6）沖門 （旁 3.5） 升，府舍（臍下 4旁 4）腹結（下 1.3） 大橫排，腹哀 （上 3）食竇（肋 5 間旁 6） 連天溪（肋 4 間旁 6），胸鄉(xiāng)（肋 3）周榮（肋2）大包（肋 6間腋中）來。腎經腎經穴位二十七，涌泉然谷 （ 舟骨粗隆下 ） 與太溪，大鐘水泉 （ 太溪下 1） 及照 海，復溜 （太溪上 2）交信（溜前 0.5） 筑賓（溪上 5）系，陰谷（半腱半膜間 ）橫骨（臍下 5旁 0.5） 連大赫（下 4），氣穴四滿中注起，肓俞 （