細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)流程

1、細(xì)胞間基本規(guī)定每次操作結(jié)束后開(kāi)啟超凈臺(tái)紫外（30 min）和房間大紫外（30 min）。顯微鏡開(kāi)啟使用后將光調(diào)暗，最后一個(gè)操作者將顯微鏡關(guān)閉。超凈臺(tái)用完收拾干凈，移液器、盒子等擺放整齊。帶走空盒子、細(xì)胞圓盤(pán)以及封口膜等任何因你而產(chǎn)生的垃圾。細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)至少需備注：所屬者，細(xì)胞系名稱細(xì)胞間冰箱內(nèi)物品至少需備注：所屬者，物品名稱?；嘈鑼?xiě)上開(kāi)啟時(shí)間。細(xì)胞培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)流程1、 細(xì)胞換液、傳代（以圓盤(pán)培養(yǎng)為例）Note：所有用于培養(yǎng)細(xì)胞的液體均需提取20-30分鐘從冰箱取出恢復(fù)到室溫或置于37的水浴箱內(nèi)。所有物品（包括雙手）進(jìn)入安全柜之前要酒精消毒。步驟：1.觀察：高倍鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)、密度以及是否染菌 2

2、.棄舊：細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)90%時(shí)，吸出培養(yǎng)基 3.漂洗：PBS（2mL） 漂洗1-2次 4.消化：加入1ml 0.25%胰蛋白酶，輕輕晃動(dòng)圓盤(pán)讓所有細(xì)胞接觸到胰酶，后吸去胰酶計(jì)時(shí)CO2 放置40s-1min,，輕輕拍打圓盤(pán)側(cè)壁促使細(xì)胞脫壁。 5.終止：吸棄胰酶后加入2ml含10%FBS的完全培養(yǎng)基終止消化。 6.吹懸：輕輕吹打混勻，(倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞完全脫壁，呈卵圓形)，吹打成單細(xì)胞懸液后按1：2 或1：3 比例傳代接種于新培養(yǎng)皿。再加入10ml全培。（大盤(pán)10ml全培，小盤(pán)6ml全培）（細(xì)胞生長(zhǎng)快留30%，慢40%-50%；其余細(xì)胞可提取蛋白或RNA） 7.培養(yǎng)：每天或每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基

3、，直至細(xì)胞生長(zhǎng)至融合時(shí)再次進(jìn)行傳代，每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長(zhǎng)情況。PS:六孔板一般加培養(yǎng)基2300L/孔。2、 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 TurboFect 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染（用于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，說(shuō)明書(shū)附后）細(xì)胞接板24 h 后轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度需達(dá)到70-90%。以6 孔板為例，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞先換液，加4ml全培。取1.5 ml 離心管，加入400 L 無(wú)血清無(wú)雙抗DMEM 培養(yǎng)液，加入質(zhì)粒2 g，混勻后靜置5 min，再轉(zhuǎn)染試劑4 L，混勻（轉(zhuǎn)染試劑是質(zhì)粒的2倍），室溫靜置1520 min。(轉(zhuǎn)染試劑需加在培養(yǎng)液中部，切忌勿貼壁;靜置時(shí)間不可超過(guò)20 min）無(wú)血清無(wú)雙抗DMEM量全培體積的10。如6孔

4、板加4mL培養(yǎng)液培養(yǎng)，即轉(zhuǎn)染體系為400ul無(wú)血清無(wú)雙抗DMEM。緩慢均勻加到培養(yǎng)液后，輕輕晃動(dòng)圓盤(pán)，使其均勻分布。轉(zhuǎn)染后6h后細(xì)胞換液，排除試劑的毒性影響。2448 h 后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Note：如果用這種方法轉(zhuǎn)染效率一直不佳，可以在接種細(xì)胞前，把轉(zhuǎn)染試劑配好，把轉(zhuǎn)染試劑加到培養(yǎng)盤(pán)上，再把細(xì)胞接種上。該方法不適用所有細(xì)胞，這種方法會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，不貼壁。HiPerFect 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染（用于siRNA的轉(zhuǎn)染，說(shuō)明書(shū)附后）For transfection of eukaryotic cells with siRNA and miRNA以6 孔板為例，轉(zhuǎn)染之前，以2mL全培接種

5、1.5-6×105 細(xì)胞于6孔板每孔。將細(xì)胞放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直至轉(zhuǎn)染。（前50%-染90%）取1.5 ml 離心管，加入100 L 無(wú)血清無(wú)雙抗DMEM 培養(yǎng)液，加入siRNA(20uM濃度，相當(dāng)于0.25ug/L)5uL,轉(zhuǎn)染試劑12L，輕輕混勻，室溫靜置5-10 min。siRNA：轉(zhuǎn)染試劑：無(wú)血清無(wú)雙抗DMEM 5uL：12ul：100ul。（比例待定）將步驟3混合液緩慢均勻加到培養(yǎng)液后，輕輕晃動(dòng)圓盤(pán)，使其均勻分布。2448 h 后收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3、 細(xì)胞凍存 （慢凍快融）1） 配凍存液：全培10%DMSO或者90%胎牛10DMSO。（保護(hù)細(xì)胞膜不被凍壞）

6、2） 提前準(zhǔn)備好程序性降溫盒。3） 標(biāo)記凍存管：帽子：細(xì)胞系名稱 凍存者 側(cè)面：細(xì)胞系名稱 凍存者 凍存時(shí)間 級(jí)別（按照細(xì)胞狀態(tài)標(biāo)記A，A，B）,太差的別凍4) 細(xì)胞經(jīng)過(guò)換液消化后，離心，棄上清.加入2ml的預(yù)先配好的凍存液，快速吹打混勻。若不離心，則在凍存管中加100LDMSO+900L細(xì)胞懸液。5) 凍存順序：用凍存儀（程序性降溫盒）80過(guò)夜液氮。 或者4半小時(shí)202小時(shí) 80存儲(chǔ)。 凍存儀的使用方法1、確認(rèn)凍存儀內(nèi)的異丙醇是否已經(jīng)使用5次，準(zhǔn)備細(xì)胞，放入凍存盒（最多18管）。2、將凍存盒放入-80冰箱，并登記信息（凍存者，凍存細(xì)胞名稱，異丙醇使用次數(shù)）3、至少三個(gè)小時(shí)后（過(guò)夜），將細(xì)胞取

7、出放置于自己的細(xì)胞盒內(nèi)或液氮中。4、將凍存盒取出放回原處。凍存盒內(nèi)需放置250ml的異丙醇，異丙醇使用4-5次后需要更新4、細(xì)胞復(fù)蘇 （DMEM培養(yǎng)液+10%FBS+1%雙抗）1) 準(zhǔn)備37水浴箱，10mL離心管，配制相應(yīng)培養(yǎng)基，標(biāo)記好培養(yǎng)皿。（離心管和培養(yǎng)皿可提前加好約5ml培養(yǎng)基）2) 將取出的細(xì)胞凍存管快速投入到溫水中，同時(shí)手握凍存管快速攪動(dòng)，讓細(xì)胞以最快的速度融解。3）吸取所有融化的細(xì)胞懸液至加有5倍體積培養(yǎng)基的離心管中。4）離心800rpm，3min。5）棄上清，加全培重懸細(xì)胞。6）依次加2ml細(xì)胞懸液和10ml全培入新培養(yǎng)皿。（6cm小圓盤(pán)上加入 2 ml的全培;10cm大圓盤(pán)上加入10ml的全培）。7）混勻(十字混勻)，CO2培養(yǎng)。標(biāo)準(zhǔn)程序：3）離心1000rpm，2-3 分鐘；棄上清，加入1ml全培重懸后轉(zhuǎn)入10ml管，再加入4-5ml全培重懸4）離心1000rpm，2-3 分