發(fā)酵工程制藥實驗-鏈霉菌發(fā)酵方案

1、實驗3灰色鏈霉菌的搖瓶種子制備實驗2灰色鏈霉菌的活化、實驗?zāi)康膶W(xué)習制備高氏一號斜面培養(yǎng)基的方法以及斜面接種技術(shù)。二、實驗原理高氏一號斜面培養(yǎng)基是一種合成培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)放線菌。三、實驗試劑與儀器1.菌種：灰色鏈霉菌;2.培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g,硝酸鉀1 g,氯化鈉0.5 g,磷酸氫二鉀0.5 g,硫酸鎂0.5 g, 硫酸亞鐵0.01 g,瓊脂20 g,水1000毫升，PH7.2 7.4 (配制時注意，可溶性淀粉要先用冷水調(diào)勻后再加入到以上培養(yǎng)基中)3.器材：天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、紗布、18mL X 180mL試管、棉花、電爐、燒杯、記號筆、酒精燈、接種環(huán)等。四、實驗步

2、驟1.高氏一號培養(yǎng)基的制備(1)按配方稱量藥品，加熱攪拌至瓊脂完全熔化，補水至lOOOmL。趁熱分裝于18mLX180mL試管，斜面以 8mL為宜。(3)分裝完畢后，塞好棉塞并將試管捆扎好。高壓蒸汽滅菌:121 C滅菌20min，滅菌后趁熱擺斜面。2.斜面接種接種是將純種微生物， 在無菌操作條件下，移植到已滅菌并適宜該菌生長繁殖所需要的培養(yǎng)基中。為了獲得微生物的純種培養(yǎng)，要求接種過程中必須嚴格進行無菌操作。一般是在無菌室內(nèi),超凈工作臺或?qū)嶒炁_酒精燈火焰旁進行。左手拿試管菌種，右手拿接種環(huán)，先將金屬環(huán)燒灼滅菌，再將接種環(huán)在空白培養(yǎng)基處冷卻,挑取菌落，在火焰旁稍等片刻。左手將試管菌種放下，拿起斜面

3、培養(yǎng)基。在火焰旁用右手小指和手掌邊緣拔下棉塞并夾緊,迅速將接種環(huán)伸入空白斜面，在斜面培養(yǎng)基上輕輕劃線，將菌體接種于其上。劃 線時由底部向上劃一直線， 一直劃到斜面的頂部。 注意勿將培養(yǎng)基劃破， 不要使菌體沾污管 壁。(3)灼燒試管口，在火焰旁將棉塞塞上。接種完畢，接種環(huán)上的余菌必須灼燒滅菌后才能放下。(4)斜面置于28C恒溫箱中，培養(yǎng) 56d觀察結(jié)果。一、實驗?zāi)康膶W(xué)習制備搖瓶種子培養(yǎng)基的方法以及種子擴大培養(yǎng)技術(shù)。、實驗原理種子擴大培養(yǎng)簡稱種子擴培，是發(fā)酵工程的一個組成部分，其指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后,再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),最終獲得一定

4、數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。其目的首先是出于接種量的需要與菌種的馴化, 同時對于縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平也有幫助。種子擴培的一般過程是:斜面菌種 7 級種子培養(yǎng)（搖瓶） 7二級種子培養(yǎng)（種子罐）7發(fā)酵前期不用種子罐，所對于種子制備過程， 其大致可區(qū)分為實驗室階段和生產(chǎn)車間階段,用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、 搖床等實驗室常見設(shè)備， 在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成,此將這一培養(yǎng)過程稱為實驗室階段的種子培養(yǎng)。而后期種子培養(yǎng)在種子罐里面進行,般在工程上歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產(chǎn)車間階段。并非所有的種子擴大培養(yǎng)都采用從搖瓶到種子罐的二級發(fā)酵模式,其實際發(fā)酵級數(shù)受到發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接

5、種量的影響。搖瓶培養(yǎng)技術(shù)問世于本世紀30年代，由于其簡便、實用，廣泛用于微生物菌種篩選、實驗室大規(guī)模發(fā)酵試驗、種子培養(yǎng)等。搖瓶培養(yǎng)設(shè)備主要有旋轉(zhuǎn)式搖床和往復(fù)式搖床兩種類型，其中以旋轉(zhuǎn)式最為常用。 振蕩培養(yǎng)中所使用的發(fā)酵容器通常為三角燒瓶,也有使用特殊類型的燒瓶或試管。振蕩培養(yǎng)技術(shù)通常用于微生物菌種的篩選或生產(chǎn)工藝的改良和工藝參數(shù)的優(yōu)化。在搖瓶培養(yǎng)過程中振蕩的目的在于改善活細胞的氧氣和營養(yǎng)物的供給。搖瓶培養(yǎng)通常以特定生長條件下的培養(yǎng)物接種，也可用孢子接種。振蕩培養(yǎng)是建立深層發(fā)酵的開始，就一特定微生物而言，振蕩培養(yǎng)時存在一最佳培養(yǎng)基配方和最佳培養(yǎng)基容量。細胞或孢子接種濃度對試驗的成功極為重要，不同

6、的微生物細胞或孢子以及不同的振蕩培養(yǎng)過程的接種濃度差異可能是十分顯著的，且各自存在一最適濃度。三、實驗試劑與儀器1.菌種：灰色鏈霉菌（由實驗二活化得到）2.培養(yǎng)基：豆餅粉20g、淀粉40g、酵母膏5g、蛋白胨5g，硫酸銨3g，硫酸鎂0.25g,磷酸二氫鉀0.2g，碳酸鈣4g，自來水1000mL、pH7.2-7.4。3.器材：天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、紗布、250mL三角瓶、棉花、電爐、燒杯、記號筆、酒精燈、接種環(huán)等。四、實驗步驟1. 搖瓶種子培養(yǎng)基的制備取干凈三角燒瓶，250ml三角瓶分裝培養(yǎng)基 30-50ml，用棉塞包扎瓶口，再加牛皮紙包扎，在 0.1MPa 下滅菌 45

7、-60min。2.接種將活化的菌種斜面，在無菌的條件下，注入10mL無菌水，震蕩成孢子懸浮液（孢子濃度約為8 X 104個/mL ）。待發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后冷卻到28C時，分別將孢子懸浮液接入三角瓶中，接種量為2mL，標好記號。3.培養(yǎng)與觀察28 C、200r/min旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)24h，觀察菌絲體形態(tài)及濃度。實驗4灰色鏈霉菌搖瓶發(fā)酵、實驗?zāi)康膶W(xué)習和掌握搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的原理和方法。、實驗原理鏈霉素是一種從灰鏈霉菌的培養(yǎng)液中提取的抗菌素,屬于氨基糖甙堿性化合物，它與結(jié)核桿菌菌體核糖核酸蛋白體蛋白質(zhì)結(jié)合，起到了干擾結(jié)核桿菌蛋白質(zhì)合成的作用，從而殺滅 或者抑制結(jié)核桿菌生長的作用。由鏈霉胍、鏈霉糖和N甲鏈霉

8、素是含有鏈霉胍的氨基糖苷類抗生素族中的主要成員,基-L-葡萄糖胺構(gòu)成的糖苷，其結(jié)構(gòu)式如下。鏈霉素中鏈霉糖部分的醛基被還原成伯醇基后,就成為雙氫鏈霉素，它的抗菌效能和鏈霉素大致相同,目前臨床上使用的是鏈霉素或雙氫鏈霉素的硫酸鹽。NHNH 忖Htih屯H0HOHiC 亠"70M甲基葡萄胺鏈霉糖生產(chǎn)過程分為兩大步驟： 發(fā)酵，將冷干管或沙土管保存的鏈霉菌孢子接種到斜面培養(yǎng) 基上，于27C下培養(yǎng)7天。待斜面長滿孢子后，制成懸浮液接入裝有培養(yǎng)基的搖瓶中，于27C下培養(yǎng)4548小時待菌絲生長旺盛后，取若干個搖瓶，合并其中的培養(yǎng)液將其接種于27C下培養(yǎng)6263小時，然后接27 C下，發(fā)酵約78種子罐

9、內(nèi)已滅菌的培養(yǎng)基中，通入無菌空氣攪拌，在罐溫 入發(fā)酵罐內(nèi)已滅菌的培養(yǎng)基中，通入無菌空氣，攪拌培養(yǎng)，在罐溫為 天。提取精制，發(fā)酵液經(jīng)酸化、過濾，除去菌絲及固體物，然后中和，通過弱酸型陽離子交換樹脂進行離子交換，再用稀硫酸洗脫，收集高濃度洗脫液一一鏈霉素硫酸鹽溶液。洗脫液再經(jīng)磺酸型離子交換樹脂脫鹽，此時溶液呈酸性，用陰離子樹脂中和后， 再經(jīng)活性炭脫色得到精制液。精制液經(jīng)薄膜濃縮成濃縮液，再經(jīng)噴霧干燥得到無菌粉狀產(chǎn)品，或者將濃縮液 直接做成水針劑。三、實驗試劑與儀器1.菌種：灰色鏈霉菌搖瓶種子（由實驗三獲得）2. 搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)培養(yǎng)基： 水解糖160g、尿素5g（單獨滅菌）、MgSO40.5g、Na2

10、HPO4l.6g、玉米漿 2535g、FeSO4 和 MnSO4 各 20mg/L，消泡齊0.3g,水 lOOOmL,pH7.2。3. 儀器：500m1三角燒瓶、旋轉(zhuǎn)式搖床等。四、實驗步驟1.搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的制備取干凈三角燒瓶，250ml三角瓶分裝培養(yǎng)基 30ml，用8層紗布包扎瓶口，再加牛皮紙包扎，在115 C下滅菌20min。2.接種待發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后冷卻到30 C時，按接種量8%10%進行接種。3.培養(yǎng)與觀察32 C、100r/min旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng) 36h40h，發(fā)酵過程中，補加滅菌尿素以增加氮源，維 持pH值。五、思考題1.觀察菌絲形態(tài)，用試紙測發(fā)酵液的pH值，并補加滅菌尿素。2.試舉

11、例說明搖瓶培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用。實驗5灰色鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物活性測定一、實驗?zāi)康膶W(xué)習和掌握抗生素抑菌性能的測定方法。、實驗原理抗生素是一種生理活性物質(zhì)，它對生命現(xiàn)象很敏感， 可以用抗生素的生物效能表示它的效價，其最小效價單元就叫做單位” (U)經(jīng)由國際協(xié)商規(guī)定出來的標準單位，稱為國際單位”(IU。通常各種抗生素的單位，是根據(jù)國家抗生素標準品測定出來的，是衡量藥物有效成份的一種尺度。抗生素的劑量常用重量和效價來表示。化學(xué)合成和半合成的抗菌藥物都以重量表示,物合成的抗生素以效價表示，并同時注明與效價相對應(yīng)的重量。效價是以抗菌效能(活性部分)作為衡量的標準，因此，效價的高低是衡量抗生素質(zhì)量的相對標準。理論效價

12、是指抗生素純品的重量與效價單位的折算比率。一些合成、半合成的抗生素多以其有效部分的一定重量(多為1卩0作為一個單位，如鏈霉素、土霉素、紅霉素等均以純游離堿1 ug作為一個單位。少數(shù)抗生素則以其某一特定的鹽的1 ug或一定重量作為一個單位。如鏈霉素堿為1000單位/mg，鏈霉素硫酸鹽為 798單位/mg，金霉素和四環(huán)素均以其鹽酸鹽純品1 ug為1單位，青霉素則以國際標準品青霉素G鈉鹽0.6 u為1單位。抗生素的效價常采用微生物學(xué)方法測定，它是利用抗生素對特定的微生物具有抗菌活性的原理來測定抗生素效價的方法，如管碟法( cylinder plate method)。管碟法是根據(jù)抗生素在瓊脂平板培養(yǎng)

13、基中的擴散滲透作用，比較標準品和檢品兩者對試驗菌的抑菌圈大小來測定供試品的效價。管碟法的基本原理是在含有高度敏感性試驗菌的瓊脂平板上放置小鋼管(內(nèi)徑6.0 ±.lmm，外徑8.0 ±.lmm，高10±).lmm)，管內(nèi)放人標準品和檢品的溶液，經(jīng)16-18小時恒溫培養(yǎng)，抗生素擴散的有效范圍內(nèi)則產(chǎn)生透明的無菌生長的區(qū)域,常呈圓形,稱為抑可計算菌圈。抑菌圈直徑大小與抗生素濃度相關(guān)，比較抗生素標準品與檢品的抑菌圈大小, 出抗生素的效價?？股匦r常采用二劑量法。將抗生素標準品和供試品各稀釋成一定濃度比例(2:1或4:1)的兩種溶液，在同一平板上比較其抗藥活性，再根據(jù)抗生素

14、濃度對數(shù)和抑菌圈直徑成直線關(guān)系的原理來計算供試品效價。取含菌層的雙層平板培養(yǎng)基，每個平板表1.測定用指示菌：枯草芽孢桿菌CCMCC(B) 63 501更能確定抗生素的醫(yī)療價值；而且使用范圍廣，較純的精制品、純度較差的制品、已知的或面放置4個小鋼管，管內(nèi)分別放入檢品高、低劑量和標準品高、低劑量溶液。測定原理與臨床應(yīng)用的要求一致,本法的優(yōu)點是靈敏度高， 需用量小，測定結(jié)果較直觀,可一次測定其總效價，是抗生素新發(fā)現(xiàn)的抗生素均能應(yīng)用；對同一類型的抗生素不需分離, 藥物效價測定的最基本方法。三、實驗試劑與儀器2.儀器：分光光度計、離心機、培養(yǎng)箱、水浴鍋、高壓蒸汽滅菌鍋、牛津小杯（不銹鋼小管，內(nèi)徑 6.0

15、 ±.lmm，外徑 8.0 ±.lmm，高 10±）.lmm ）、培養(yǎng)皿等。3.培養(yǎng)基（1）傳代用培養(yǎng)基（用于枯草芽孢桿菌菌傳代和保藏）:蛋白胨10g，牛肉膏3.0g,氯化鈉 5.0 g,瓊脂 18g,蒸餾水 lOOOmL, pH7.2-7.5。（2）生物測定用培養(yǎng)基（培養(yǎng)基 I）蛋白胨5g，牛肉浸出粉3g，瓊脂1520g，磷酸氫二鉀3g，蒸餾水lOOOmL，除瓊脂外，混合上述成分，調(diào)節(jié)PH值使比最終的pH值略高O. 2-O.4,加人瓊脂，加熱溶化后濾過,調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7. 8? 8. O,在115C，滅菌3O分鐘。4.試劑（1）標準鏈霉素（標準品理論計算值

16、為798.3u/mg）： 0.61.6單位/mL（2） O.85%NaCI 溶液（生理鹽水）1OOmL。（3） 1%pH7.8磷酸緩沖液：取磷酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀O.41g,加水使溶解成lOOOml，即得。四、實驗步驟1枯草芽孢桿菌菌懸液的制備將枯草芽孢桿菌接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面，在3537C培養(yǎng)7天，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應(yīng)有芽孢 85%以上。用無菌水將芽孢洗下，在65C加熱3O分鐘，備用。2上層培養(yǎng)基的準備將已滅菌的生物測定用培養(yǎng)基1OOmL，融化后放入5OC恒溫水浴中，待溫度平衡后，加入枯草芽孢桿菌菌懸液 5mL ,充分搖勻，備用。3平板的制作取滅菌培養(yǎng)皿，每皿用大口移液管

17、吸入 5OC左右的測定培養(yǎng)基 2OmL，水平放置，待凝固后用大口移液管吸入上層培養(yǎng)基5mL ,將培養(yǎng)皿來回傾側(cè)（要迅速），使含菌上層培養(yǎng)基均勻分布，凝固后備用，雙碟不得少于4個。4放置小鋼管放置小鋼管時，注意管與管之間不能太靠近， 否則會引起相鄰的兩個抑菌圈之間的抗生素擴散區(qū)中的濃度增大， 相互影響形成卵圓形或橢圓形抑菌圈。管與雙碟邊緣同樣也不能太靠近，因為液面浸潤作用，邊緣的瓊脂培養(yǎng)基菌層為非平面,會影響抑菌圈的形狀?？稍谠囼炃霸陔p碟的底上用尺測量， 作好標記，試驗中可以按照雙碟底面標記放置小鋼管，避免放置位置不恰當產(chǎn)生的問題。 小鋼管放置時，要小心地從同一高度垂直放在菌層培養(yǎng)基上,得下陷，

18、不得傾斜，不能用懸空往下掉的方法。放置之后，不能隨意移動，要靜置5min,使之在瓊脂內(nèi)稍下沉降穩(wěn)定后，再開始滴加抗生素溶液。5滴加抗生素溶液滴加抗生素要按照 SH7TH 7 SL7TL （二劑量法，S代表標準品，T代表供試品，H代表高濃度，L代表低濃度）的順序滴加，在一雙碟對角的2個不銹鋼小管中分別滴裝高濃度及低濃度的標準品溶液,其余2個小管中滴裝相應(yīng)的高低兩種濃度的供試品溶液;高低濃度的劑距為2:1或4:1。液面應(yīng)該與小鋼管管口齊平，液面反光呈黑色。（抗生素液體加入量不能按滴計算，即使同一滴管，每滴的量也有差異。）如果抗生素溶液滴加過滿，可以用無菌濾紙片小心吸去多余部分。6雙碟中菌株的培養(yǎng)滴加了抗生素溶液后的雙碟忌震動，要輕拿輕放。在搬運到培養(yǎng)箱的過程中，可以預(yù)先在培養(yǎng)箱中墊上報紙鋪平，再把雙碟連同墊于桌上的玻璃板小心運至培養(yǎng)箱，緩慢推入箱內(nèi)。雙碟在35C 37 C下培養(yǎng)約1