土壤淀粉酶產(chǎn)生菌的分離純化及相關(guān)性質(zhì)測定

1、土壤淀粉酶產(chǎn)生菌的分離純化及相關(guān)性質(zhì)測定摘要：為了了解土壤中微生物的種類和特征并從中分離出淀粉酶產(chǎn)生菌， 行純化和培養(yǎng)，并測定其產(chǎn)生的淀粉酶的活性以及對其進(jìn)行生理生化試驗(yàn)， 其代謝特征，需要進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)，并在此過程中掌握分離純化微生物、 物液體培養(yǎng)法、透明圈法測定淀粉酶活力以及生理生化試驗(yàn)的操作方法和原理。 主要實(shí)驗(yàn)過程如下：從土壤中篩選淀粉酶產(chǎn)生菌后進(jìn)行復(fù)篩， 所得發(fā)酵液用于淀粉酶活力的測定以及生理生化反應(yīng)。關(guān)鍵詞：土壤淀粉酶產(chǎn)生菌 分離純化 發(fā)酵培養(yǎng) 透明圈法 正文：1、土壤淀粉酶產(chǎn)生菌的分離與純化 1.1實(shí)驗(yàn)原理在自然條件下，微生物常常在各種生態(tài)系統(tǒng)中群居雜聚。對其進(jìn) 了解 微生接著

2、進(jìn)行種子培養(yǎng),生理生化試驗(yàn)為了研究某種微生物的特性，或者大量培養(yǎng)和利用某一種微生物，必須事先從有關(guān)的生態(tài)環(huán)境中分 離出所需的菌株，獲得純培養(yǎng)。獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的純種分離法， 也 即是從含有多種雜居在一起的微生物材料中，通過稀釋分離、劃線分離、單抱子 分離等方法，使它們分離成為單個個體并在固定培養(yǎng)基的固定地方繁殖成為單個 菌落，從單個菌落中挑選所需純種。不同微生物可用不同培養(yǎng)基和不同培養(yǎng)條件 進(jìn)行單菌分離獲得純種，純種再經(jīng)繁殖培養(yǎng)后，可用于進(jìn)一步研究形態(tài)、生理等 欲從含有多種微生物的樣品中直接辨認(rèn)出，并且取得某種所需微生物的個體進(jìn)行 純培養(yǎng)，那是困難的。由于微生物可以形成菌落，而每個單

3、一菌落常常是由一種 個體繁殖而成。不同微生物的菌落是可以識別和加以鑒定的。 因此將樣品中不同 微生物個體在特定的培養(yǎng)基上培養(yǎng)出不同的單一菌落， 再從選定的某一所需菌落 中取樣，移植到新的培養(yǎng)基中去，就可以達(dá)到分離純種的目的。這就是純種分離 法的原理。在微生物的分離和純種培養(yǎng)過程中，必須使用無菌操作技術(shù)。所謂無菌操作, 就是在分離、接種、移植等各個操作環(huán)節(jié)中，必須保證在操作過程中杜絕外界環(huán) 境中的雜菌進(jìn)入培養(yǎng)的容器。淀粉是有葡萄糖通過a -1,4糖苷鍵構(gòu)成的直鏈淀粉和a -1,6位有分支的直鏈淀粉組成的。按照水解方式的不同，主要的淀粉酶可以分為a -淀粉酶、P -淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和異淀粉酶4

4、大類。產(chǎn)淀粉酶的微生物有細(xì)菌、霉菌和酵 母等。利用淀粉遇碘變?yōu)樗{(lán)色的特性，將分離的微生物接種在含有淀粉的固體培 養(yǎng)基表面進(jìn)行培養(yǎng)，利用滴加碘液后菌落周圍出現(xiàn)透明圈，未水解的淀粉呈藍(lán)色,水解圈無色，判斷是否產(chǎn)生淀粉酶及初步判斷淀粉酶活力的高低。從微生物群體中經(jīng)分離、生長，在平板上形成的肉眼可見的菌落，不一定是 單個細(xì)胞生長繁殖而成的，有的可能來自2個或者多個細(xì)胞。因此，純培養(yǎng)的確 定觀察菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征等綜合考慮。甚至有些微 生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過一系列的分離與純化過程和多種特征鑒定方能得到。1.2實(shí)驗(yàn)器材土壤樣品、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、99ml無菌

5、水1瓶（帶玻璃珠）、5支9ml無菌水/試管等。1.2.1材料1.2.2用具棒、三角棒）無菌培養(yǎng)基、無菌吸管、無菌水、酒精燈、無菌涂布棒（又名擴(kuò)散 、接種環(huán)、生物潔凈工作臺、生化培養(yǎng)箱、人工智能培養(yǎng)箱、手動 菌落計(jì)數(shù)器（SC6、移液器、移液槍、試管、三角瓶、顯微鏡等。1.3實(shí)驗(yàn)過程1.3.1 土壤稀釋液的制備稱取土壤，制備稀釋度分別為10-3、10-4、10-5、10-6、10-7 土壤稀釋液。1.3.2稀釋平板法從土樣中分離真菌先在無菌培養(yǎng)皿中加入稀釋度為10-7的土壤稀釋液0.2mL,再加入馬鈴薯培養(yǎng)基，充分混勻鋪平并凝固后倒置于 2830C恒溫培養(yǎng)56d,培養(yǎng)完成后觀察真菌菌落形態(tài)。結(jié)果如

6、圖1所示，培養(yǎng)基上分布有多個菌落，根據(jù)顏色判斷為有 兩種真菌，一種正面為青色，背面為肉色，有 9個菌落，另一種正面為墨綠色,背面為黑色，有霉味，有3個菌落。圖1稀釋平板法分離真菌結(jié)果1.3.3平板涂抹法分離土壤中的放線菌先在無菌培養(yǎng)皿中倒入適量淀粉培養(yǎng)基，鋪成平板，凝固后，再加入稀釋度為10-7的土壤稀釋液0.2mL,用無菌三角玻棒在平板表面涂抹均勻，倒置于2830C條件下培養(yǎng)34d,觀察放線菌菌落形態(tài)。結(jié)果如圖2所示，并沒有分離得到單菌落，而只有菌苔，顏色為黃色，有泥腥味。沒有出現(xiàn)單菌落可能是操作 出現(xiàn)差錯，因?yàn)橄♂尪葹?0-7，并沒有偏大，所以可能是操作的問題。圖2平板涂抹法分離放線菌結(jié)果

7、1.3.4平板劃線法分離土壤中的細(xì)菌先在無菌培養(yǎng)皿中倒入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，制成平板，再用分區(qū)劃線法挑取稀釋度為10-2的土壤稀釋液一環(huán)在平板上劃線。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置于2830r培養(yǎng)。觀察細(xì)菌菌落形態(tài)，結(jié)果如圖3所示，有肉眼可見的單菌落, 直徑約為3mm顏色為肉色，有臭味。圖3平板劃線法分離細(xì)菌結(jié)果1.3.5用劃線分離法對淀粉酶產(chǎn)生菌進(jìn)行分離純化1.3.5.1在分離出真菌的馬鈴薯培養(yǎng)基的平板上滴加碘液，如圖4所示，可以看 出僅有一個菌落的水解圈較大符合要求， 挑取該菌落，在淀粉培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線 分離，倒置30r培養(yǎng)。結(jié)果如圖5所示。圖4滴加碘液后的馬鈴薯培養(yǎng)基圖5淀粉培養(yǎng)基上分離純化得

8、到的真菌1.3.5.2 在分離出細(xì)菌的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上挑取單菌落，在淀粉培養(yǎng)基上進(jìn) 行劃線分離，倒置30C培養(yǎng)，結(jié)果如圖6所示，有單菌落。圖6淀粉培養(yǎng)基上分離純化得到的細(xì)菌1.3.5.3 將淀粉培養(yǎng)基上分離純化得到的單菌落接種到斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至成 熟，待用。1.4結(jié)果與分析 1.4.1由圖1觀察可得真菌的菌落特征，本實(shí)驗(yàn)中分離得到的為霉菌，有兩種,一種正面為青色，背面為肉色，另一種正面為墨綠色，背面為黑色，有霉味，菌 落較大且疏松，菌落比較干燥，用接種環(huán)挑取菌落時較難，說明與培養(yǎng)基結(jié)合牢 固。1.4.2由圖2觀察可得放線菌的菌落特征，本實(shí)驗(yàn)中沒有得到單菌落，為菌苔,比較干燥，顏色為黃色

9、，菌落較小，分布緊密，帶有泥腥味。1.4.3由圖3觀察可得細(xì)菌的菌落特征，菌落小且突起，直徑約為3mm較濕,顏色為肉色，有臭味，用用接種環(huán)挑取單菌落時較容易，說明不與培養(yǎng)基結(jié)合。1.4.4由圖4觀察知有一個菌落的水解圈直徑較大，為淀粉酶產(chǎn)生菌。1.5結(jié)論 1.5.1對土壤中微生物進(jìn)行分離篩選，觀察各種微生物的菌落形態(tài)，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1-1所示。含水狀態(tài)干燥較干燥較濕外觀形態(tài)大而疏松小而緊密小而突起菌落透明度不透明不透明稍透明菌落與培養(yǎng)基結(jié)合程度結(jié)合較牢固結(jié)合牢固不結(jié)合菌落顏色青色和墨綠色黃色肉色氣味霉味泥腥味臭味1.5.2在淀粉培養(yǎng)基上分離得到的單菌落，為淀粉酶產(chǎn)生菌，再接種到斜面上進(jìn)行培養(yǎng)

10、，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的材料。2、淀粉酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng) 2.1實(shí)驗(yàn)原理微生物發(fā)酵是生物工程的重要組成和基礎(chǔ)。它主要是利用微生物的特定性 狀，通過現(xiàn)代工程技術(shù)進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)有用物質(zhì)的技術(shù)體系。微生物發(fā)酵既是開 發(fā)生物資源的關(guān)鍵技術(shù)，又是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的重要環(huán)節(jié)。根據(jù)微生物發(fā)酵方式的不同，可以將發(fā)酵分為固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵。 固態(tài)發(fā) 酵又稱固體發(fā)酵，是一種傳統(tǒng)的發(fā)酵方法，即將發(fā)酵的固體原料按一定的比例與定量水分混合后進(jìn)行滅菌，然后接種菌種。液態(tài)發(fā)酵又稱為液體發(fā)酵，將所用原料配成液體狀態(tài)，接種菌種進(jìn)行發(fā)酵。液態(tài)發(fā)酵又可分為淺盤發(fā)酵和液體深層 發(fā)酵。液體深層發(fā)酵采用密閉的發(fā)酵罐，在罐中進(jìn)行發(fā)酵。液體發(fā)酵大致分

11、為三大工序：種子培養(yǎng)，發(fā)酵，提取。2.2實(shí)驗(yàn)器材2.2.1菌種：大腸桿菌，枯草芽抱桿菌，前期實(shí)驗(yàn)分離得到的菌種。2.2.2儀器：超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、發(fā)酵罐、發(fā)酵尾氣分析儀、移液器、接種環(huán)、酒精燈、記號筆等。2.2.3培養(yǎng)基：液體發(fā)酵培養(yǎng)基 2.3實(shí)驗(yàn)過程 2.3.1搖瓶發(fā)酵30mL種子培養(yǎng)基231.1種子培養(yǎng)：取活化好的菌種由斜面培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接入盛有的250mL錐形瓶內(nèi)，與轉(zhuǎn)速180-220r/min旋轉(zhuǎn)式搖床上30C培養(yǎng)1-2天。2.3.1.2 發(fā)酵：吸取培養(yǎng)好的種子液3mL接入多個盛有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的的 錐形瓶內(nèi)，于180-220r/min恒溫?fù)u床上30C培養(yǎng)2-3天。2.3.1

12、.3 提取：取發(fā)酵液 20mL平均分配到兩個離心管中，12000r/min離心 10mi n,分別收取上清液和菌體，分別保存在冰箱中。2.3.2全自動發(fā)酵罐的基本了解全班同學(xué)分為兩批由老師介紹全自動發(fā)酵罐的基本構(gòu)造和基本操作方法。2.4結(jié)果與分析本次實(shí)驗(yàn)得到的上清液為黃色，菌體為淡黃色。保留，作為后續(xù)試驗(yàn)淀粉酶 活性測定及微生物生理化反應(yīng)的材料。3、淀粉酶的活性測定 3.1實(shí)驗(yàn)原理淀粉酶包括幾種催化特點(diǎn)不同的成員，其中a淀粉酶隨機(jī)地作用于淀粉的非還原端，生成麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖，同時使淀粉漿的粘度下降, 因此又稱為液化酶；伕淀粉酶每次從淀粉的非還原端切下一份子麥芽糖， 又被稱 為糖化

13、酶。產(chǎn)淀粉酶的微生物在以可溶性淀粉為底物配置的固體培養(yǎng)基生長， 其 菌落周圍的培養(yǎng)基會由白色變成灰色且透明，形成透明圈。在一定濃度范圍內(nèi), 透明圈的直徑d與淀粉酶活力的大?。▽?shù)值）成正比。以已知濃度的淀粉酶為 對照，制作透明圈與淀粉酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線。 從樣品的透明圈直徑大小可在標(biāo)準(zhǔn)曲 線上求得其淀粉酶活性大小。由于本方法是直接測定方法，而且靈敏度高，不需 要特殊設(shè)備，故被廣泛采用。3.2實(shí)驗(yàn)器材 3.2.1菌種：產(chǎn)淀粉酶微生物 3.2.2培養(yǎng)基：培養(yǎng)基n：培養(yǎng)基I加2g/L的可溶性淀粉和2g/L的瓊脂，透明 圈測定使用。3.2.3儀器和其他用具：搖床、恒溫培養(yǎng)箱、紙片、移液槍、鑷子、淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)

14、品、尺子、小試管、容量瓶、離心機(jī)。3.3實(shí)驗(yàn)過程 3.3.1 取取濃度為 1mg/mL 2mg/mL 3mg/mL 4mg/mL 5mg/mL 6mg/mL的淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品，滴于紙片上，使用6個培養(yǎng)基，每副培養(yǎng)皿放置4張紙片，置 于培養(yǎng)基的方式簡單表示如下:2 14 36 5 x 1 x 5 x 6置放完成之后，在37C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18-20h 。3.3.2透明圈直徑的測定培養(yǎng)完成后取出，在培養(yǎng)基上滴加碘液，一段時間后，測定透明圈直徑（cm，結(jié)果如表3-1所示:表3-1標(biāo)準(zhǔn)淀粉酶溶液及樣品透明圈直徑（cm記錄表1mg/mL2.552.72mg/mL2.7533mg/mL33.054mg

15、/mL3.23.35mg/mL3.253.36mg/mL3.253.32樣品3.13.12.753.35樣品的透明圈直徑第3組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與前兩組相差較大（分別為2.6cm和2.55cm）, 故舍去。3.4結(jié)果與分析 3.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線測得的透明圈直徑取平均值，淀粉酶溶液濃度換算為酶活力，制得表3-2如下:表3-2標(biāo)準(zhǔn)淀粉酶溶液數(shù)據(jù)處理結(jié)果表序號透明圈直徑（cm淀粉酶活力（U/g）淀粉酶活力對數(shù)值12.62537003.56822.87574003.86933.025111004.04543.250148004.17053.275185004.26763.285222004.346根據(jù)數(shù)據(jù)處理結(jié)果

16、作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線342樣品酶活力計(jì)算實(shí)驗(yàn)測得樣品的透明圈直徑平均值為 3.067cm,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得線性方 程y=0.916x-0.6487，計(jì)算得樣品的淀粉酶活力對數(shù)值為 4.056，從而得出樣品的 淀粉酶活力為11376.3U/g。3.5結(jié)論 3.5.1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得線性方程為y=0.916x-0.6487。3.5.2被測發(fā)酵液樣品的淀粉酶活力大小為 11376.3U/g。4、淀粉酶產(chǎn)生菌的初步鑒定（生理生化試驗(yàn)） 4.1實(shí)驗(yàn)原理細(xì)菌的代謝與呼吸主要取決于酶的催化作用，各種細(xì)菌具有不同的酶系組代謝產(chǎn)物而另一些不同細(xì)菌成，因此表現(xiàn)在對某些含碳化合物及含氮化合物的分解利用情

17、況不同, 也有所不同，有些微生物能分泌淀粉酶將淀粉水解為麥芽糖或葡萄糖;微生物分泌脂肪酶，將脂肪水解為甘油和脂肪酸。葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞后, 經(jīng)不同途徑發(fā)酵葡萄糖，產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物。這不但充分體現(xiàn)了細(xì)菌代謝類型 的多樣性。同時，微生物對碳氮化合物的分解利用的生理生化反應(yīng)也是微生物菌 種鑒定的重要依據(jù)之一。4.1.1糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)是最常用的生化反應(yīng)，在腸道細(xì)菌的鑒定上尤為 重要。絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類作為碳源和能源，但是他們在分解糖的能力上 有很大的差異，有些細(xì)菌能分解某種糖并產(chǎn)生酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣 體（如氫、甲烷、二氧化碳等）；有些細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。例如大腸桿菌能分解 乳糖和葡

18、萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣；傷寒桿菌能分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能分解乳糖； 普通變形桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能分解乳糖。酸的產(chǎn)生可用指示劑來顯示, 在配制糖發(fā)酵培養(yǎng)基時，已預(yù)先加入溴甲酚紫（PH6.8以上時呈紫色，PH5.2以 下時呈黃色）。當(dāng)細(xì)菌發(fā)酵糖而產(chǎn)酸時，會使培養(yǎng)液由原來的紫色變?yōu)辄S色。氣 體的產(chǎn)生可由糖發(fā)酵管中倒立的德漢氏小管中有無氣泡來指示。4.1.2 V.P試驗(yàn)V.P試驗(yàn)是用來測定某些細(xì)菌利用葡萄糖產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物的能力，如丙酮酸，丙酮酸進(jìn)行縮合、脫羧后，產(chǎn)生中性的乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在堿性條件下，被空氣中的氧氣氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中精氨酸的胍基起作用生成紅色化合物，

19、此即為V.P陽性反應(yīng)。當(dāng)試管中加a-萘酚時可以促進(jìn)反應(yīng)的出現(xiàn)。4.1.3甲基紅試驗(yàn) 甲基紅試驗(yàn)是用來檢測由葡萄糖產(chǎn)生的有機(jī)酸，如甲酸、乙 酸、乳酸等。在細(xì)菌代謝糖產(chǎn)生酸的過程時，培養(yǎng)基就會變酸，使加入培養(yǎng)基中 的甲基紅指示劑由橙黃色（PH6.2）轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色（PH4.4），即甲基紅反應(yīng)。4.2實(shí)驗(yàn)器材 4.2.1菌種：大腸桿菌、枯草芽抱桿菌、前期實(shí)驗(yàn)分離得到的產(chǎn)淀粉酶菌株等。4.2.2培養(yǎng)基：糖發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖、乳糖）、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基、胰蛋白胨水培養(yǎng)基。4.2.3 試劑：甲基紅試劑、40% KOH、5%a-萘酚等。4.3實(shí)驗(yàn)過程 4.3.1糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)分別接種大腸桿菌、枯草芽抱桿菌、前期分離

20、到的未知菌于糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基（葡萄糖、乳糖）中，另一支不接種，37r培養(yǎng)24h后，取出觀察是否有顏 色變化及是否有氣體產(chǎn)生。接種有大腸桿菌的培養(yǎng)液變成黃色，并且有氣體產(chǎn)生, 其他三支試管均無明顯現(xiàn)象。如圖4-1所示為葡萄糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基的結(jié)果， 圖4-2為乳糖發(fā)酵液體培養(yǎng)基的結(jié)果。圖4-1葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖圖4-2乳糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖4.3.2 V.P 試驗(yàn)分別接種大腸桿菌、枯草芽抱桿菌、前期分離到的未知菌于葡萄糖蛋白胨 培養(yǎng)基中，另一支不接種，37r培養(yǎng)24h后，在三支菌管內(nèi)加40% KOH20 滴, 再加等量的a-萘酚溶液，拔去硅膠塞，用力振蕩后于 37 r保溫30min，取出觀 察是否出現(xiàn)紅色。接種有枯草芽抱桿菌的培養(yǎng)液變成紅色，其他均無明顯現(xiàn)象。 如圖4-3所示為加入40% KOH和a -萘酚之前的結(jié)果。（由于在實(shí)驗(yàn)過程中往接 有枯草芽抱桿菌的試管中加 a-萘酚時出現(xiàn)意外，打翻了一部分，但并沒有影響 到結(jié)果的觀察，但之后并沒有拍照，因此沒有實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。）圖4-3 V.P試驗(yàn)加入試劑之前的結(jié)果圖4.3.3甲基