滅蚊真菌貴陽腐霉總RNA提取方法的建立

1、滅蚊真菌貴陽腐霉總RNA提取方法的建立     滅蚊真菌貴陽腐霉總RNA提取方法的建立段斯亮于聲蘇曉慶(柳州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，檢驗教研室廣西柳州545006;貴陽醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室)摘要目的提取貴陽腐霉(Pythium guiyangense)的總RNA。方法誘導(dǎo)后的菌絲加入硅藻土，用液氮研磨成粉末狀，在變性劑存在的條件下，用酚/氯仿/異戊醇抽提，除去DNA和蛋白質(zhì)，再用醋酸鈉和70%乙醇沉淀RNA，去除多糖。結(jié)果用該方法提取的RNA樣品，經(jīng)紫外分光光度計檢測，OD260/OD280=198，OD260/OD230=23

2、0;1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，28SrRNA帶的亮度約為18SrRNA帶的2倍。結(jié)論成功地提取了貴陽腐霉總RNA，且RNA的純度和完整性很好，能夠達到進行分子生物學(xué)領(lǐng)域其他操作研究的標(biāo)準。    關(guān)鍵詞貴陽腐霉硅藻土RNA提取      中圖分類號R 392文獻標(biāo)識碼A文章編號20952694(2012)0102002    在基因表達調(diào)控研究中，RTPCR(逆轉(zhuǎn)錄多聚合酶鏈反應(yīng))、Northern分析、cDNA文庫(含一種生物體所有基因編碼的cDNA分子的克降群)的構(gòu)建等都需要高質(zhì)量的RNA，獲

3、得完整性良好的RNA已成為分子生物學(xué)各研究領(lǐng)域首先要解決的問題。在所有的RNA實驗中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。    RNA酶很穩(wěn)定，一般而言反應(yīng)不需要輔助因子，而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起嚴重的后果。目前，許多RNA提取方法已建立起來，這些方法均用到RNAase(核糖核酸酶)的抑制劑如肌鹽、酚、氯仿、氯化艷密度梯度離心等13，但是，仍有不少實驗材料由于富含RNA酶、多糖、多酚等物質(zhì)或者降解RNA及與RNA形成難溶物等方式嚴重干擾RNA的提取4，5，常常導(dǎo)致實驗的失敗。我們在用RTPC

4、R克隆貴陽腐霉的類枯草菌素蛋白酶基因時，發(fā)現(xiàn)用一步法提取RNA，結(jié)果并不理想，污染和降解現(xiàn)象較多。為了解決上述問題，我們在參考多種RNA提取技術(shù)的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了一種簡單、有效的適合腐霉菌的RNA提取方法。    1材料與方法    11材料111供試菌種。貴陽腐霉(Pguiyangense)，由本實驗室保存。    112培養(yǎng)基。SFE培養(yǎng)基    6，誘導(dǎo)培養(yǎng)基7。    113主要試劑。RNA提取液為:異硫氫酸胍6 mol/L，TrisHCl

5、(pH 75)02 mol/L，NaCl 05mol/L，EDTA 001mol/L，SDS 1%，015mol/L巰基乙醇;硅藻土;酚/氯仿/異戊醇(v/v 25:24:1);NaAc(3mol/L，pH55);70%乙醇(DEPC水配制);異丙醇。    12方法切取1cm×1cm SFE培養(yǎng)基活化5天的菌塊，轉(zhuǎn)入100mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基，26，110rpm振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)至所需時間，收集菌絲，用DEPCH2O過濾沖洗干凈并濾干(盡量干燥)。    置于研缽中加入硅藻土，倒入液氮研磨至粉末狀，趁液氮尚未揮發(fā)光，把粉末(約08g

6、)轉(zhuǎn)移到RNasefree的15mL離心管中，加入10mLRNA提取液，劇烈振蕩混勻，冰浴15min。加入200L酚/氯仿/異戊醇(v/v 25:24:1)混勻，冰浴15min。4，12000r/min離心20min。取上清移入另一RNasefree的15mL離心管中，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(v/v 25:24:1)再抽提一次;轉(zhuǎn)移上清，加入等體積冰凍異丙醇，20放置60min。    【基金項目】廣西教育廳科研項目(編號:200810MS026)，柳州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校碩士研究生科研啟動項目(編號:2007Y01)。    4，

7、12000r/min離心20min。棄上清液，將RNA沉淀用DEPCWater溶解，加入15mL 3mol/L NaAc，0過夜。4，10000r/min離心20min。用70%乙醇洗滌沉淀2次，室溫晾干，加入30L DEPCWater溶解沉淀。立即使用或70保存。    13 RNA質(zhì)量的檢驗    131 RNA的純度。用BECKMAN紫外分光光度計測量樣品在230nm、260nm、280nm處的OD值，計算OD260/OD230、OD260/OD280的結(jié)果。    132 RNA的完整性。1%瓊脂

8、糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，28SRNA與18SRNA的亮度比約為2。    2結(jié)果    21 RNA的純度吸取1LRNA，用99L超純水稀釋100倍，在BECKMAN紫外分光光度計中檢測，OD260/OD280=198，OD260/OD230=230，說明RNA純度很高，無蛋白質(zhì)、酚類污染。    22 RNA的完整性取1gRNA樣品進行1%瓊脂糖凝膠(含1g/mL溴化乙錠)電泳，130v電泳40min后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察，結(jié)果顯示28SrRNA、18SrRNA與5SrRNA帶型整齊，無拖尾，而且28

9、S帶的亮度約為18S帶的2倍，5S帶的亮度較低，說明RNA完整性很好，點樣孔中及其附近也未發(fā)現(xiàn)有DNA的污染。見圖1。    圖1貴陽腐霉RNA電泳圖    3討論貴陽腐霉是一種絲狀真菌，富含RNase、多酚、多糖。多糖具有與RNA相似的理化性質(zhì)，在提取總RNA時，多糖等易與RNA一起沉淀下來，RNase易使RNA發(fā)生降解8。所以使用一步法提取RNA，污染和降解現(xiàn)象嚴重。考慮到以上因素，本方法特別采用了能吸附RNA酶的硅藻土研磨。一般的提取方法都是采用液氮研磨，但由于真菌材料使用了液體培養(yǎng)，即使過濾后菌絲體仍含有較多的水分，液氮冷凍會

10、形成冰晶而妨礙研磨。    研磨時間越長，就越增加RNA酶污染的機會。而硅藻土是一種黏土，能吸附RNA酶9，有效抑制RNase活性，而且使得研磨過程更加容易和快速。并且實驗中把變性劑中異硫氫酸胍的濃度·20·河北聯(lián)合大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)2012年1月第14卷第1期Journal of Hebei United University(Health Sciences)2012 January，14(1)提高15倍，在細胞破碎后能強烈抑制RNase活性。一步法使用酚/氯仿/異戊醇抽提一次，DNA污染嚴重;而本方法用酚/氯仿/異戊醇多次抽提，使RNA留在

11、水相而DNA和蛋白質(zhì)進入有機相，能將蛋白質(zhì)清除干凈，去除DNA污染。用醋酸鈉沉淀RNA粗品，能除去高含量的多糖，結(jié)果表明，此步的改動較一步法可除去絕大部分的多糖，且RNA樣品完好。    在檢測RNA樣品的完整性時，考慮到變性瓊脂糖凝膠電泳較麻煩，且上樣量較多，我們采用了非變性瓊脂糖凝膠電泳。從圖1中可見，RNA電泳后28S、18SrRNA與EB的結(jié)合量比值約為2:1，表明RNA未發(fā)生明顯降解;點樣孔中及其附近也未發(fā)現(xiàn)有DNA的污染;28SrRNA后拖尾，可能與上樣量較多有關(guān)，也與采用非變性瓊脂糖凝膠電泳有關(guān)。    本實驗結(jié)果表明，

12、此方法能夠獲得高純度完整的RNA，其效果優(yōu)于傳統(tǒng)的一步法，適用于富含RNase和多糖的腐霉菌絲總RNA的提取，為貴陽腐霉功能基因的表達研究奠定了基礎(chǔ)，同時也為其它真菌總RNA的提取提供了一定的參考依據(jù)。    參考文獻    1Baker S S，Rugh C L，Kamalay J CRNA and DNA isolation from re-calcitrant plant tissuesJBioTechniques，1990，9(3):2682Mullin A E，Soukatcheva G，Verchere C B，et al

13、Application of insi-tu ductal perfusion to facilitate isolation of highquality RNA frommouse pancreasJBiol Techniques，2006，40(5):6173Levi A，Galau G A，Wetzstein H YA rapid procedure for the isolationof RNA from highphenoliccontaining tissues of pecanJHortSci，1992，27(12):13164李宏，王新力植物組織RNA提取的難點及對策J生物技

14、術(shù)通報，1999，15(1):365Lewinsohn E，Steele C L，Croteau RSimple isolation of functionalRNA from woody stems of gymnospermsJPlant Mol Biol Rep，1994，12(1):206Jaronski stSimplified production system for the fungus Lagenidiumgiganteum for operational mosquito controlJMogwto news，1984，44(3):3777王榮新貴陽腐霉(Pythium

15、guiyangense)Pr1蛋白酶的誘導(dǎo)、初步純化及其酶學(xué)特性研究D貴陽:貴陽醫(yī)學(xué)院，20058方衛(wèi)國，楊星勇，張永軍，等真菌核酸的一種快速提取方法J應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2002，8(3):3059Even S，Lindley N D，CocaignBousquet MMolecular physiology ofsugar catabolism in Lactococcus lactis IL1403JJ Bacteriology，2001，183(13):3817(20110829收稿)(王一伊編輯)阿托伐他汀對急性冠脈綜合征患者血中TNF、TGF、IFN和hsCRP水平的影響周雪梅喬健

16、(江蘇省無錫市第三人民醫(yī)院江蘇無錫214000)摘要目的探討阿托伐他汀對急性冠脈綜合征患者(ACS)血中可溶性超敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)、腫瘤壞死因子(TNF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、干擾素(IFN)含量的調(diào)控。方法用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和免疫比濁法分別檢測了50例ACS患者治療前后血中TNF、TGF、IFN及hsCRP水平。結(jié)果ACS患者血清TNF、TGF、IFN及hsCRP水平均高于健康志愿者，加服阿托伐他汀的患者4周后血中hsCRP、TNF和IFN水平均明顯下降，而TGF升高。實驗結(jié)果表明，阿托伐他汀可降低ACS患者血清hsCRP水平，此外阿托伐他汀上調(diào)了血清TGF，并可能由

17、此下調(diào)TNF和IFN水平。結(jié)論ACS患者血清hsCRP水平升高與冠脈炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，常規(guī)阿司匹林治療時加服阿托伐他汀可明顯降低ACS患者血清及hsCRP水平，改善冠心病患者的預(yù)后，此外，鑒于細胞因子在炎癥中廣泛的作用，阿托伐他汀可能通過上調(diào)TGF而下調(diào)IFN和TNF緩解炎癥從而改善病情。    關(guān)鍵詞阿托伐他汀hsCRP TNFTGFIFN      中圖分類號R 96文獻標(biāo)識碼A文章編號20952694(2012)0102102    急性冠脈綜合征(Acute Coronary Syndr

18、ome，ACS)是一組由急性心肌缺血引起的臨床綜合征，包括Q波性心肌梗死、非Q波性心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛，其病理基礎(chǔ)是冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂或糜爛，繼發(fā)完全或不完全閉塞性血栓。超敏C反映蛋白(hsCRP)和ACS的發(fā)病密切相關(guān)，是用于診斷和監(jiān)測藥物治療效果的重要指標(biāo)1，2。有研究表明:腫瘤壞死因子(TNF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、干擾素(IFN)等多種炎癥相關(guān)的細胞因子也參與了ACS的病理過程35。    由于ACS和血栓形成關(guān)系密切，目前治療多以抗血小板為目的的藥物為主6，如長期服用阿司匹林，然而，越來越多的研究表明，ACS和人體脂代謝也有密切關(guān)系7，因此，