以異檸檬酸裂解酶為靶點(diǎn)篩選抗持留結(jié)核分枝桿菌藥物

1、以異檸檬酸裂解酶為靶點(diǎn)篩選抗持留結(jié)核分枝桿菌藥物         09-08-27 14:42:00     作者：肖春玲    編輯：studa20【摘要】  進(jìn)入21世紀(jì)，結(jié)核病仍然是臨床上發(fā)病率和死亡率最高的傳染病之一。目前，結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的多重耐藥，以及在抗結(jié)核藥物作用過(guò)程中結(jié)核分枝桿菌的持留狀態(tài)，已成為全世界結(jié)核病控制工作的主要障礙。異檸檬酸裂解酶(isocitr

2、ate lyase，ICL)是乙醛酸循環(huán)途徑中的關(guān)鍵限速酶之一，決定了結(jié)核分枝桿菌的持留性。在文中我們將描述異檸檬酸裂解酶的基本性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征，希望能通過(guò)對(duì)ICL抑制劑作用區(qū)域的了解來(lái)推動(dòng)抗持留結(jié)核分枝桿菌藥物的研究。 【關(guān)鍵詞】  異檸檬酸裂解酶； 結(jié)核分枝桿菌； 持留狀態(tài)    ABSTRACT  Getting into the 21st century, tuberculosis remains a leading cause of mortality worldwide. The main obstacles to the globa

3、l control of the disease are emerging multi-drug resistant strains of Mycobacterium tuberculosis and the recalcitrance of persistent infections to treatment with conventional anti-TB drugs. Isocitrate lyase (ICL) is a key rate-limiting enzyme in the glyoxylate bypass, and it is needed for persistent

4、 Mycobacterium tuberculosis to get energy. Consequently, isocitrate lyase is an attractive targets for the development of new antituberculosis agents. In this paper, the characteristion and structure of ICL were decribed. Our understanding of the inhibitor-bound sites will provide a springboard to f

5、ind drugs which target the tuberculosis infection.    KEY WORDS  Isocitrate lyase;  Mycobacterium tuberculosis;  Persistent infections    結(jié)核分枝桿菌的持留狀態(tài)是治療結(jié)核病的瓶頸之一。處于持留狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌，其生長(zhǎng)速度極為緩慢甚至不生長(zhǎng)，以此來(lái)躲避抗結(jié)核藥物的攻擊。人體的免疫系統(tǒng)及現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物可以迅速殺死處于生長(zhǎng)狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌，但對(duì)于處在非生長(zhǎng)狀態(tài)的持留結(jié)核

6、分枝桿菌卻無(wú)能為力。一旦患者的免疫力下降或停止用藥，持留結(jié)核分枝桿菌將大量生長(zhǎng)繁殖，重新處于活躍的致病狀態(tài)1，2。這是全球防治結(jié)核病工作的主要障礙之一。因此，我們迫切需要研發(fā)出新型的抗結(jié)核藥物，特別是對(duì)持留狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌有殺滅作用的藥物。此類藥物的研制對(duì)縮短結(jié)核病的治療時(shí)間，降低耐多藥結(jié)核病的發(fā)生，減少結(jié)核病的復(fù)發(fā)和患者的再感染幾率有著極為重要的意義。    近年來(lái)，研究學(xué)者在結(jié)核分枝桿菌的持留性發(fā)生和保持機(jī)制方面取得了一些進(jìn)展，這些研究成果將對(duì)新型結(jié)核藥物的研發(fā)有重要的推動(dòng)作用。    1  持留結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞

7、中存活    不同于其他通過(guò)逃避吞噬而致病的細(xì)菌，結(jié)核分枝桿菌能通過(guò)多種機(jī)制，利用宿主細(xì)胞表面的多個(gè)受體(包括甘露糖受體、補(bǔ)體受體、和Fc受體)進(jìn)入巨噬細(xì)胞，并在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活。研究顯示，宿主細(xì)胞表面的甘露糖受體能選擇性的結(jié)合結(jié)核分枝桿菌H37Rv毒株，并且該受體的表達(dá)能被干擾素下調(diào)，因此在結(jié)核分枝桿菌感染早期的攝入中可能發(fā)揮重要作用3。    巨噬細(xì)胞可以產(chǎn)生具有抗微生物活性的活性氧或活性氮，抵抗巨噬細(xì)胞的殺傷是結(jié)核分枝桿菌毒力的關(guān)鍵4。結(jié)核分枝桿菌有兩種編碼超氧化物歧化酶蛋白的基因sodA和sodC。sodA編碼錳、鐵超氧化物歧化

8、酶，它是結(jié)核分枝桿菌大量分泌的胞外蛋白之一。sodC編碼銅、鋅超氧化物歧化酶，其分泌量較少。超氧化物歧化酶(SOD)的功能是將O2-轉(zhuǎn)變成分子氧和過(guò)氧化氫，消除O2-的毒性作用，并且可以通過(guò)其他反應(yīng)防止大量過(guò)氧化氫的產(chǎn)生。SodA和SodC蛋白能幫助結(jié)核分枝桿菌防止超氧化物的毒性作用以及抵抗活性巨噬細(xì)胞呼吸暴發(fā)產(chǎn)生的氧化物的殺傷5。    Jun等觀察到結(jié)核分枝桿菌的eis(enhanced intracellular survival)基因可以增強(qiáng)結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力。當(dāng)eis基因受到損傷后，結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)生存能力大大降低，同時(shí)發(fā)

9、現(xiàn)eis基因只出現(xiàn)于致病性的分枝桿菌或是實(shí)驗(yàn)室中產(chǎn)生的工程菌，而不存在于其他為數(shù)眾多的非致病分枝桿菌6。    2  異檸檬酸裂解酶與結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)持續(xù)存活的關(guān)系    圖1    異檸檬酸裂解酶催化反應(yīng)3  異檸檬酸裂解酶的基本介紹    異檸檬酸裂解酶對(duì)于結(jié)核分枝桿菌在體內(nèi)的持續(xù)感染至關(guān)重要，了解異檸檬酸裂解酶的某些基本性質(zhì)，特別是能影響其活性的重要位點(diǎn)，將有效地推動(dòng)以異檸檬酸裂解酶為靶點(diǎn)的抗結(jié)核藥物的研發(fā)。   

10、; 3.1  表達(dá)條件    當(dāng)向最低限度培養(yǎng)基中補(bǔ)充乙酸鹽或棕櫚酸鹽時(shí)，結(jié)核分枝桿菌表達(dá)異檸檬酸裂解酶的水平將顯著上調(diào)。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，不論培養(yǎng)基是以什么作為碳源，異檸檬酸裂解酶都可以實(shí)現(xiàn)低限度的表達(dá)9。    結(jié)核分枝桿菌表達(dá)ICL的水平與其對(duì)氧的利用率有直接關(guān)系，在通風(fēng)條件下培養(yǎng)12周所表達(dá)的ICL總量比相同培養(yǎng)基相同時(shí)間內(nèi)缺氧培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌表達(dá)該酶數(shù)量明顯減少。Wayne等觀察到結(jié)核分枝桿菌在適應(yīng)氧濃度較低條件生存時(shí)，其表達(dá)的ICL的酶活性有短暫的提升10。在宿主細(xì)胞內(nèi)，結(jié)核分枝桿菌面對(duì)著無(wú)游離氧的缺氧環(huán)境，其氧呼吸

11、代謝關(guān)閉，啟動(dòng)乙醛酸支路獲取能量。    3.2  結(jié)構(gòu)特征    異檸檬酸裂解酶在細(xì)菌(Kornberg，1966)、古生菌(Serrano et al.，1998)、酵母(Taylor et al.，1996)、真菌(Lorenz and Fink，2001)以及高等植物(Eastmond and Graham，2001)中普遍存在。    在M.tuberculosis中由icl基因編碼的異檸檬酸裂解酶是一個(gè)由428個(gè)氨基酸組成的含有四個(gè)亞單位的蛋白11，每個(gè)亞單位由14個(gè)螺旋和14個(gè)折疊

12、組成(圖2、圖3)。這一結(jié)構(gòu)最顯著的特征是亞單位螺旋之間的相互交換。這種交換在其他酶蛋白中可以保證穩(wěn)定的二聚體的形成，并有利于產(chǎn)生顯著的構(gòu)象改變以便使其活性環(huán)狀區(qū)域與底物相結(jié)合12。    這個(gè)蛋白的核心由8個(gè)螺旋(411)和8條折疊(25，8，1214)前后交錯(cuò)形成圓桶狀結(jié)構(gòu)。一個(gè)螺旋(12)處于8個(gè)折疊的后方， 這個(gè)    圖2    異檸檬酸裂解酶四聚體結(jié)構(gòu)圖3    ICL四聚體亞單位結(jié)構(gòu)    螺旋和另2個(gè)螺旋(13和14)與相鄰的亞基

13、產(chǎn)生獨(dú)特的相互作用。5個(gè)折疊(6，7，9，10，11)組成一個(gè)結(jié)構(gòu)域，處于蛋白核心圓筒結(jié)構(gòu)的上方，這個(gè)結(jié)構(gòu)域包括了許多酶的活性位點(diǎn)區(qū)域。例如，一個(gè)緊鄰殘基Glu247的大約包括100160個(gè)氨基酸的序列位于這一結(jié)構(gòu)域，此序列在許多植物表達(dá)的ICL中都存在，其功能可能與靶向作用于過(guò)氧化物酶體有關(guān)13。    上述-結(jié)構(gòu)域中含有ICL的一個(gè)重要催化殘基K189KCGH193，此殘基位于一個(gè)可變型的環(huán)形模體中，可通過(guò)構(gòu)象變化與底物相結(jié)合。K189KCGH193中含有親核性的半胱氨酸(Cys191)，當(dāng)酶與底物結(jié)合后，Cys191與底物相鄰，并且與底物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而封

14、閉活性區(qū)域。    通過(guò)生物信息學(xué)的分析我們得知ICL蛋白可以分為兩大類，他們以不同的長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)域組成而區(qū)分。第一類由小的真細(xì)菌類ICL蛋白組成，其中就包括結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生的異檸檬酸裂解酶。這一類的ICL蛋白含有結(jié)構(gòu)域1、3，結(jié)構(gòu)域1包括了保守的催化模體KKCGH。第二類由中等長(zhǎng)度的植物以及真菌ICL蛋白組成，除了結(jié)構(gòu)域1、3還包括第一類ICL蛋白所缺少的結(jié)構(gòu)域214，15。    3.3  催化機(jī)制    異檸檬酸裂解酶將異檸檬酸的C-C鍵可逆地裂解，使異檸檬酸裂解為乙醛酸和琥珀酸。異檸檬酸裂

15、解酶的催化機(jī)制正是由這一裂解過(guò)程的逆反應(yīng)所揭示的。乙醛酸首先深入ICL的活化位點(diǎn)區(qū)域并與之結(jié)合，琥珀酸再加入形成三重復(fù)合物。這一過(guò)程中關(guān)鍵的一個(gè)步驟是琥珀酸中質(zhì)子的去質(zhì)子化。K189KCGH193殘基中的Cys191在鄰近His193的協(xié)助下使親核的質(zhì)子從琥珀酸的第二個(gè)碳原子上脫離16。抑制劑與ICL結(jié)合后，這兩個(gè)位點(diǎn)移動(dòng)了5，這直接導(dǎo)致質(zhì)子無(wú)法轉(zhuǎn)移。至于C-C鍵是如何斷裂的，還有待于進(jìn)一步研究。    3.4  金屬離子、pH對(duì)ICL酶活力的影響    在缺乏二價(jià)陽(yáng)離子的情況下，經(jīng)過(guò)純化的異檸檬酸裂解酶只有極微弱的活性；然

16、而加入Mg2+或Mn2+后則恢復(fù)了酶活。培養(yǎng)環(huán)境中含有5mmol/L的Mg2+異檸檬酸裂解酶的活性最大，Mn2+被認(rèn)為可以代替Mg2+，但其激活能力只為Mg2+的39%。Robertson等在研究大腸埃希菌表達(dá)的ICL時(shí)也證明Mn2+可以替代部分Mg2+對(duì)異檸檬酸裂解酶活性的激活作用17，而其他二價(jià)陽(yáng)離子如Co2+、Fe2+、Ca2+、Ba2+、Ni2+、Cd2+、Zn2+、Cu2+和Hg2+則不能明顯的激活酶的活性。Glachetti等證明異檸檬酸裂解酶的真正底物不是異檸檬酸，而是Mg2+異檸檬酸復(fù)合物18，以此說(shuō)明為何Mg2+對(duì)ICL具有激活作用。    學(xué)者

17、混合兩種等量的二價(jià)金屬離子，以測(cè)定其對(duì)異檸檬酸裂解酶的抑制性。發(fā)現(xiàn)Ca2+和Ba2+的混合試劑無(wú)法抑制ICL的酶活性；Mn2+與Zn2+混合可以抑制將近25%的酶活；其他陽(yáng)離子的抑制率無(wú)法達(dá)到更高的水平。    ICL的酶活性有pH依賴性。在pH為6.87.0的酶反應(yīng)體系中，異檸檬酸裂解酶的活性最高。pH低于6或高于8時(shí)酶活性僅為最大酶活的一半；而當(dāng)pH高于9，酶活性則完全喪失。    3.5  結(jié)核分枝桿菌中的另一種異檸檬酸裂解酶    通過(guò)對(duì)結(jié)核分支桿菌(H37Rv)基因組的序列分析人們發(fā)現(xiàn)

18、了第二種編碼異檸檬酸裂解酶的基因aceA。推測(cè)aceA是由于移碼突變而形成的開(kāi)放閱讀框(ORF)，其被認(rèn)為是一個(gè)假基因(pseudogene)。這個(gè)基因表達(dá)的蛋白由766個(gè)氨基酸組成，蛋白的分子量約為84.3ku。    盡管都可以表達(dá)異檸檬酸裂解酶，但這兩個(gè)基因(icl和aceA)的作用并不相當(dāng)，有證據(jù)表明aceA不能補(bǔ)充icl的缺失8。生化方面的研究顯示AceA的異檸檬酸裂解酶活性明顯低于ICL的酶活，AceA只是對(duì)ICL的輔助，并不能在乙醛酸支路中發(fā)揮作用。但由于AceA與ICL有一些共同的活性區(qū)域(如KKCGH)14，如果找到對(duì)這兩個(gè)蛋白均有抑制作用的抑制劑，其作用位點(diǎn)則更