DNA提取方法和PCR循環(huán)次數對STR擴增成功率的影響

1、C h i ne se J o u rna l o f Fo re n s i c M ed i c i ne 2005年第20卷第3期 【資金資助】公安部科技基金資助項目(20011121401【作者簡介】嚴江偉(1974-,男,江蘇揚州人,主檢法醫(yī)師,博士研究生,主要從事法醫(yī)物證學研究。DNA 提取方法和PCR 循環(huán)次數對ST R 擴增成功率的影響嚴江偉1,3,唐暉1,王靜1,張慶霞1,高俊薇1,任賀2,劉雅誠1(1.北京市公安局法醫(yī)檢驗鑒定中心,北京100085;2.北京市人民警察學院,北京100088;3.中國科學院北京基因組研究所,北京101318【摘要】目的探討常見載體上的微量血痕

2、DNA 的提取方法、PCR 循環(huán)次數對STR 擴增成功率的影響。方法分別應用Chelex -100法及Chelex -100結合純化法對8種載體上不同大小的血痕樣本進行DNA 提取,并采用28次、30次及34次PCR 循環(huán)進行ST R 擴增,分別觀察其擴增成功率。結果經28次、30次及34次PCR 循環(huán),Chelex -100法提取DNA 后的STR 擴增成功率分別為0.2917,0.3333,0.4583,Chelex -100結合純化法的STR 擴增成功率分別為0.3750,0.4583,0.8750。結論用Chelex -100結合純化法提取DNA,用34次循環(huán)擴增可提高STR 基因座的

3、檢測成功率?！娟P鍵詞】法醫(yī)物證學;DNA 提取;DNA 純化;ST R 基因座;PCR 【文獻標識碼】A 【文章編號】1001-5728(200503-0151-03I nfluence of D NA extracti on m ethod and PCR cycle nu m ber on STR ana lysis /(Y AN J iang 2wei,T ANG Hui,WANG J ing,et al ./Forensic M edical Exam ination &Identification Center of B eijing PublicS ecu rity B u rea

4、u,B eijing 100085,China 【Abstract 】O bjecti ve To study the influence of different DNA extracti on methods combined differentPCR cycle nu mbers on ST R analysis fr om trace bl oodstain on vari ous carrier often seen in f orensic area .M ethods U sing Chelex -100and Chelex -100combine with DNA purifi

5、cati on,f oll owed by a mp lified with Pr ofiler Plus at 28,30and 34PCR cycles res pectively .Results Success rati os of STR analysis with Chelex -100DNA extracti on method is 0.2917,0.3333and 0.4583res pectively,while Chelex -100combined with purificati on method is 0.3750,0.4583and 0.8750res pecti

6、vely .Conclusi on Chelex -100combined with purificati on DNA extracti on method while a mp lified with 34cycles can increase the success rati os of ST R analysis with trace bl oodstain .【Key words 】Forensic bi ol ogical evidence;DNA extracti on;DNA purificati on;ST R l oci;PCRChelex -100法于1989年被Sing

7、er -Sa m 1等人最先用于提取組織培養(yǎng)細胞DNA ,1991年W alsh 2等人系統地研究了該方法在多種法醫(yī)學生物檢材中的具體應用,證實該方法適用于包括血痕、精斑等在內的絕大多數法醫(yī)學生物檢材的DNA 提取。有學者研究表明,應用Chelex -100法結合DNA 純化技術3,另輔以適當增加PCR 循環(huán)數的策略,可以極大提高PCR 擴增成功率。本文作者對使用上述方法提取常見載體上微量血痕DNA 擴增ST R 的成功率進行比較,旨在探討常見載體微量血痕DNA 提取方法及PCR 循環(huán)次數對ST R 擴增成功率的影響。1材料與方法1.1樣本制備數,提高檢測靈敏度?！緟⒖嘉墨I】1Gill P .

8、App licati on of l ow copy nu mber DNA p r ofilingJ .Cr oatian Medical Journal ,2001,42:229-232.2顧麗華,平原,程莉,等.模板DNA 用量對熒光ST R 復合擴增檢測的影響J .中國法醫(yī)學雜志,2002,17(2:77-80.3裴黎.現代DNA 分析技術理論與方法M .北京:中國人民公安大學出版社,2002.168-176.4陳松,胡蘭.低拷貝模板ST R 分型及其存在的問題J .中國法醫(yī)學雜志,2003,18(5:314-316.(收稿日期:2004-04;修回日期:2004-12151 C h

9、i ne se Jo u rna l o f Fo ren s i c M e d i c i ne2005年第20卷第3期于木塊、牛仔布、棉布、泥塊、生銹的鐵片、玻璃、石塊、磚塊等8種常見血痕載體上,分別滴加0.1l(組、0.2l(組、0.3l(組E DT A抗凝靜脈血,每組血量分別在各載體上同時制備2份,置室溫、通風環(huán)境下保存1周。1.2DNA提取直接剪取牛仔布和棉布載體上的血痕和用去離子雙蒸水浸濕的棉線(0.5c m長引取其余6種硬質載體上血痕,置于0.5m l離心管中,分別用Chelex-100法2及Chelex-100純化法提取DNA。其中Chelex-100純化法,即在裝有血痕的離

10、心管中加入5%Chelex-100(B i o-Red公司40l和PK(10mg/m l5l,振蕩混勻后,56水浴3h;100干熱器上放置8m in,振蕩,離心3m in(13000r/m in,吸出上清后轉入M icr ocon-100超濾離心管(M illi pore公司中,離心45m in(6500r/m in,反轉離心1m in;(14000r/m in;收集濃縮液,使體積至10l,待擴增。1.3PCR擴增與ST R分型檢測擴增按Amp Fl ST R Pr ofiler Plus T M試劑盒(AB I公司美國操作手冊步驟進行,其中熱循環(huán)條件中的循環(huán)次數分別采用28、30、34次。S

11、TR分型在3100型基因分析儀(AB I公司上完成。2結果與討論8種載體上的血痕用2種DNA提取方法提取DNA,經3ST R檢驗結果見表1。表18種載體上血痕用兩種不同DNA提取方法和經3種不同PCR循環(huán)次數得到的STR檢驗結果Table1STR Loci Pr ofiled using t w o different DNA extracti onmethods and3PCR cycle nu mbers fr om8carrier載體Chelex-100法Chelex-100純化法棉布8/9/99/9/99/9/99/9/99/9/99/9/9牛仔布0/2/20/2/35/2/71/5/

12、93/7/95/9/9木塊0/0/25/6/69/9/95/7/95/7/99/9/9玻璃6/9/99/9/99/9/99/9/99/9/99/9/9鐵片0/0/20/0/24/0/40/2/90/2/94/4/9磚塊0/1/16/7/79/7/92/2/46/6/99/9/9石塊6/6/97/8/99/9/98/8/98/8/99/9/9泥塊0/0/00/0/00/3/50/2/30/3/76/8/9注表中數字代表PCR擴增28、30、34次循環(huán)后檢測到的STR基因座數目NoteThe figures show the nu mber of ST R Loci Pr ofiled using

13、 28,30,34cycles表1結果顯示:用Chelex-100法提取樣本DNA,28次循環(huán)時,7個樣本可成功檢測到9個STR 分型結果,8個樣本檢測到部分STR分型結果,9例樣本未得到檢測結果;30次循環(huán)時,8個樣本可成功檢測到9個STR分型結果,10個樣本檢測到部分STR分型結果,6個樣本未得到檢測結果;34次循環(huán)時,11個樣本可成功檢測到9個ST R分型結果,11個樣本檢測到部分STR分型結果,2個樣本未得到檢測結果。用Chelex-100純化法提取樣本DNA,28次循環(huán)時,9個樣本可成功檢測到9個ST R分型結果,11個樣本檢測到部分ST R分型結果,4個樣本未得到檢測結果;30個循

14、環(huán)時,10個樣本可成功檢測到9個STR分型結果,14個樣本檢測到部分STR分型結果, 34次循環(huán)時,除3個樣本未檢測到完整STR分型結果外,其余21個樣本均成功檢測到9個STR分型結果。在法醫(yī)學實踐中,常規(guī)的PCR循環(huán)數為28次。該研究循環(huán)數分別采用28、30及34次,雖然增加PCR循環(huán)數提高了微量血痕樣本的ST R成功檢出率(圖1,但同時這也使得實驗室環(huán)境和操作污染對樣本STR分型的干擾作用變得更加明顯4。因此,在對微量樣本進行DNA分析時,防止實驗室環(huán)境污染和規(guī)范實驗操作顯得尤為重要。另外,循環(huán)數的增加,使得ST R分型結果中易出現等位基因擴增不均衡、影子帶和等位基因丟失等現象4。據此,作

15、者建議,在對這類樣本分析時,除要同時檢測陽性和陰性(載體基質,試劑樣本外,還應重復檢驗,以保證最終檢驗結果的可靠性。Chelex-100是一種螯合樹脂,由苯乙烯與二乙烯苯共聚體組成,含有成對的亞氨基二乙酸鹽離子,起著螯合基團作用,對多價金屬離子有極強親和力。在低離子強度及加熱條件下,檢材基質中的金屬離子可以輔助DNA酶降解DNA,還會抑制PCR反應。在提取DNA反應體系中加入適量Chelex-100,螯合金屬離子,可防止DNA降解,并提高PCR擴增成功率。Chelex-100法提取DNA時不需轉換離心管,雖能減少污染機會,防止DNA丟失等,但由于該方法提取到的模板DNA純度相對較差,對于微量降

16、解檢材常常會導致ST R檢驗失敗或檢測基因座結果不全。另外,由于Chelex-100的螯合金屬離子的過程是可逆的,因此,用該方法提取的DNA樣本不適合長期保存5。Chelex-100純化法,采用了M icr ocon-100濃縮柱,其中的超濾膜可以有效地截留一定片段大小的DNA,而其它成份則被過濾,從而濃縮、純化微量血痕中有限數量的DNA3。本實驗結果表明:Chelex-100法聯合使用純化方法提取DNA,可以大大提高微251C h i ne se J o u rna l o f Fo re n s i c M ed i c i ne 2005年第20卷第3期 量血痕樣本的ST R 檢出率。

17、圖1磚塊血痕經Chelex 純化法提取DNA 后,分別使用三種PCR 循環(huán)數后得到的檢驗結果(128循環(huán);230個循環(huán);334個循環(huán)F i g 1The genotyp ing result of bl ood stain on brick Chelex -100combined with DNA purificati on method f oll o wed by three different PCRcycle nu mber (128cycle,230cycle,334cycle 圖2不同載體使用2種DNA 提取方法經28個循環(huán)后能夠檢測到STR 基因座的成功率(C:棉布;J:牛仔布;

18、W :木塊;G:玻璃;I :鐵片;B:磚塊;S:石塊;CL:泥土F i g 2The success rati os of DNA typ ing by t w o DNA extracti onmethods f oll o wed by 28PCR cycles (C:Cott on;J:Jean:W:Wood;G:Glass;I :Ir on;B:B rick;S:St one;C L:Clay 由本文結果可以看出,各種不同載體基質上微量血痕的STR 檢驗成功率有很大的不同(圖2。表面光滑的載體基質,如玻璃、石塊載體上的微量血痕,ST R 檢驗成功率較高;相反,表面粗糙的載體基質,如磚塊

19、,木塊等,STR 檢驗成功率則較低。其主要原因是此類載體上血痕用濕棉線往往不能全部擦拭下來,從而大大減少能提取到的DNA 的模板量,尤其是對微量血痕DNA 的提取。另外,牛仔布、泥塊等檢材由于存在某些化學抑制物6,其對PCR 反應的抑制而導致STR 檢驗常常失敗。Chelex -100結合純化法提取DNA ,可以最大程度地去除各種抑制物,從而使對這類檢材進行STR 檢驗的成功率大大提高。(感謝公安部物證鑒定中心黃正光老師對本文撰寫的指導【參考文獻】1Singer -Sa m J,Tanguay RL,R iggs AD.U se of Chelex t oi m p r ove the PCR signal fr om a s mall nu mber of cells J .Amp lificati on,1989,3:11-16.2W a