豬胰島在糖尿病大鼠不同部位異種移植的實驗研究

1、    豬胰島在糖尿病大鼠不同部位 異種移植的實驗研究        摘要研究了豬胰島在糖尿病大鼠腦室、 胸腺、 腎包膜下、 門靜脈等具有“免疫學特惠”的部位異種移植的效果。 結果顯示， 在不使用免疫抑制劑的情況下， 豬胰島在這四個部位均能糾正大鼠的高血糖狀態(tài)， 并能維持正常血糖一段時間， 其中腦室組的移植物平均功能存活時間較胸腺組、 腎包膜下組、 門靜脈組明顯延長(P0.05)。 同時還發(fā)現(xiàn)門靜脈內(nèi)移植后， 血糖下降、 上升曲線最陡， 腦室組血糖下降最晚而上升曲線

2、則較平緩。 結果認為， 這些“免疫特惠部位”均是相對、 不完全的， 從免疫學角度看腦室是更適宜的豬胰島移植部位； 而從正常生理功能角度看門靜脈內(nèi)則是作用最迅速的部位。關鍵詞豬胰島異種移植排斥反應 Experimental study on xenotransplantation of porcine pancreatic islets to different sites of diabetic ratsWan Chidan, Chen Shi, Chen Gang, et al. Institute of Organ Transplantation, Tongji Medical Unive

3、rsity, Wuhan 430030AbstractThe efficacy of xenotransplantation of porcine pancreatic islets to different "immunologic privileged sites" in rats, such as ventricle of cerebrum (VC), thymus (TH), under renal capsule (URC), and portal vein (PV) was investigated. The results demonstrated that

4、porcine pancreatic islets transplanted into the four sites could control the hyperglycemic state in the rats and maintain normal blood glucose concentration for a period of time without using any immunosuppressant. The average functional survival of xenografts in VC group was longer than the other t

5、hree groups (TH, URC, and PV), with the difference being significant (P0.05)， but there was no significant difference among the other three groups (P0.05). It was also observed that the curves of blood glucose declination and elevation in PV group were the steepest, while the blood glucose level in

6、CV group declined relatively late, and increased smoothly and slowly. It is suggested that all of these "immunologic privileged sites" are relative. With the view of immunology, ventricle of cerebrum is a more appropriate site for xenotransplantation of porcine pancreatic islets. In terms

7、of normal physiological function, portal vein is the site where porcine islets can play its role fastest.Key wordsPorcine pancreatic islet Xenotransplantation Rejection胰島移植部位與移植效果關系明顯， 并影響移植物存活。 本實驗根據(jù)同種胰島移植部位研究結果1，2， 選用有免疫特惠作用或免疫弱反應部位即腦室、 胸腺、 腎包膜下及門靜脈內(nèi)等來比較豬胰島異種移植效果。材料與方法一、 大鼠糖尿病模型制作與分組封閉群SD大鼠，體重2002

8、50g，雌雄不拘，(本校實驗動物中心提供)。 用20g*L-1鏈脲霉素(美國Sigma公司)以70mg*kg-1劑量經(jīng)大鼠后肢肌肉注射。 一周內(nèi)二次至少間隔2天采尾血測血糖，血糖均大于22.2mmol*L-1者為糖尿病模型鼠。模型鼠隨機分成5組：1組：側腦室移植組(n=10)；2組： 胸腺內(nèi)移植組(n=7)；3組： 腎包膜下移植組(n=7)；4組：門靜脈內(nèi)移植組(n=7)；5組：糖尿病鼠對照組(n=6)。 各組術前、 術后均未予免疫抑制劑治療。二、 豬胰島的制備供體為本地雜種豬， 體重60kg左右， 雌雄不限。 豬胰島的制備采用本所創(chuàng)制的機械法3。 豬胰腺經(jīng)4肝素生理鹽水灌洗后切取， 清除被膜

9、、 胰管、 血管后剪成2mm35mm3大小碎塊， 置XB-型細胞懸液制備器(上海放射醫(yī)學研究所制造)中研磨。 研磨液經(jīng)400目細胞篩網(wǎng)過濾后即得初胰島， 再經(jīng)Hinshaw法純化后用肝素生理鹽水制成細胞懸液， 取少量細胞懸液進行活性、 純度及計數(shù)檢查后4保存?zhèn)溆谩?總冷缺血時間不超過4小時。三、 移植方法各受體鼠均用乙醚開放吸入麻醉； 豬胰島移植數(shù)量為20 000個胰島/公斤； 術后常規(guī)青霉素治療3天， 20萬U*d-1。1. 側腦室移植： 用大鼠腦定位儀俯臥位水平固定鼠頭后， 顱頂正中切口約1cm， 分離皮下組織至骨膜。 定位于前囟后1.5mm， 正中旁開1.52mm， 用自制小鉆鉆開顱骨，

10、 孔徑約1mm， 注意勿損傷大腦皮層。 再用固定于定位儀的注射器針頭(4.5號)經(jīng)鉆孔垂直下降4mm(以針尖半個斜面進入顱面為基準)或56mm(以針尖在顱骨表面為基準)。 若推注通暢， 回抽阻力小， 有水泡， 則為側腦室穿刺成功。 液體量為50l， 1分鐘內(nèi)緩慢推注， 注完后留針5分種。 最后用明膠海綿封閉顱孔。2. 胸腺內(nèi)移植： 仰臥位， 胸骨切跡上正中切口， 鈍性分離皮下組織及頸前肌群直至暴露氣管， 再沿氣管向尾端分離直至可見到胸腺兩葉上極， 注意勿弄破胸膜， 造成氣胸。 分別鉗起胸腺兩葉上極包膜， 用4.5號針頭穿刺胸腺。 胸腺兩葉注射液體量為100l。 最后用8-0絲線扎閉穿刺孔， 防

11、止細胞液溢出。3. 腎包膜下移植： 游離左腎， 切開其上極包膜后， 用4.5號針頭從上極沿包膜下間隙穿刺至下極， 稍許剝離下極包膜后注射。 注射量為100l。4. 門靜脈內(nèi)移植： 尋找并游離一段門靜脈小分枝， 用4.5號針頭從小分枝處穿刺入門靜脈。 注射液體量為200l， 1分鐘左右緩慢推注。 注射完畢后， 結扎小分枝近端。四、 移植效果判斷每日觀察各組大鼠尿量及飲食活動情況， 并從尾靜脈采血測血糖(Beckmann血糖分析儀)。 以血糖11.1mmol*L-1判定為移植物存活， 移植有效； 連續(xù)2次血糖11.1mmol*L-1結果一、 純化后豬胰島數(shù)量為17.5萬左右， 純度為65%， 臺盼

12、蘭染色活率在95%以上； 未經(jīng)培養(yǎng)的新鮮豬胰島移植前行刺激釋放試驗顯示， 高糖條件下胰島素釋放量為低糖的2.48倍， 提示移植前豬胰島功能良好。二、 糖尿病鼠對照組在2周觀察期間血糖值均在22.2mmol*L-1以上， 無一只出現(xiàn)糖尿病狀態(tài)的自行緩解。 多飲、 多食、 多尿現(xiàn)象明顯， 精神及活動均差。三、 各實驗組移植前后平均最低血糖值比較均有極顯著性差異。 移植后血糖均不同程度降至11.1mmol*L-1以下， 糖尿病癥狀明顯改善。四、 各組移植物平均存活時間為： 側腦室組18.10±7.25天； 胸腺組8.86±4.14天； 腎包膜下組7.29±3.69天；

13、門靜脈組5.56±1.70天。 側腦室移植組移植物平均存活時間較其他三組長(P0.05)， 但血糖下降較晚， 血糖上升曲線平緩； 其他三組移植物平均存活時間無顯著性差異， 血糖下降較快， 以門靜脈組下降最快， 血糖上升曲線陡峭(見附)。附14組豬胰島移植后平均血糖變化曲線 五、 側腦室組在移植過程中， 有2例出現(xiàn)癲癇及顱內(nèi)高壓癥狀(易激惹、 抽搐等)， 腦電變化明顯， 有高尖波出現(xiàn)， 于術后1天內(nèi)死亡， 未統(tǒng)計在本組。 而本組統(tǒng)計的10例， 術前、 術后腦電無明顯變化。六、 病理學檢查： 胰島排斥后取移植部位標本檢查。 1組全腦切片中， 蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)可檢見散在胰島樣細胞， 細胞間相互

14、分離， 其外周有淋巴細胞及吞噬細胞浸潤， 少數(shù)標本可見毛細血管及管室膜上皮細胞增生， 靜脈管周可見少數(shù)淋巴細胞袖套樣浸潤， 腦實質(zhì)水腫， 部分神經(jīng)元呈中央性Nissl小體溶解， 神經(jīng)元軸索亦呈水腫； 24組胰島細胞少見， 可見小圓淋巴細胞浸潤， 各部位組織及細胞結構基本正常。討論胰島制備的質(zhì)量和數(shù)量以及排斥反應是影響移植效果的主要因素。 本實驗采用未經(jīng)培養(yǎng)等預處理的新鮮胰島， 用多于同種移植一倍的數(shù)量(約4 500個豬胰島/鼠)進行異種移植， 目的是為了保存胰島的數(shù)量及其良好活性， 減少胰島丟失及損傷環(huán)節(jié)。 14組糖尿病大鼠血糖均能在術后降至正常， 且術前、 術后平均最低血糖值比較有極顯著性差

15、異， 這一結果表明， 未經(jīng)預處理的新鮮豬胰島同樣能有效糾正高血糖狀態(tài)， 且最長有功能存活時間達29天， 反映了在異種胰島移植中， 首先要保證充足的胰島數(shù)量及良好活性， 在此基礎上考慮采用一些預處理措施來降低其免疫原性， 才有可能取得更好療效。利用所謂的“免疫特惠”或免疫弱反應部位進行移植是減輕胰島移植排斥反應的一種方法， 異種胰島移植在這方面的報道極少， 本實驗選用側腦室、 胸腺、 腎包膜下和門靜脈內(nèi)等具有“免疫特惠”或免疫弱反應性部位進行研究。 結果表明， 在不使用免疫抑制劑的情況下， 豬胰島在大鼠這四個部位均能發(fā)揮作用， 逆轉(zhuǎn)高血糖狀態(tài)并能有功能存活維持一段時間， 其中側腦室組胰島有功能時

16、間最長， 效果最好， 其原因可能是由于側腦室特殊的解剖學特征及免疫屏障作用， 而相對缺乏體液免疫成分及細胞免疫的刺激作用(如天然抗體、 補體及APC等)， 其排斥反應與誘生抗體有關而較晚發(fā)生； 而其它三個部位內(nèi)移植豬胰島細胞暴露于外周循環(huán)， 其免疫屏障及免疫特性相對較弱， 容易導致天然抗體和補體沉積， 易對細胞免疫產(chǎn)生激活作用， 而使排斥反應較早發(fā)生4。 實驗同時表明， 這四個部位均不同程度發(fā)生延遲性異種排斥反應， 導致血糖回升， 病理學檢查亦見有細胞浸潤， 說明這些部位的“免疫特惠”或免疫弱反應性作用亦是相對、 不完全的， 都是“不完全免疫特惠區(qū)”1。本實驗還發(fā)現(xiàn)腦室組血糖下降較晚， 上升曲

17、線平緩， 這與國外文獻報道一致， Lee等報道腦室內(nèi)胰島素濃度是外周血的2倍， 這可能是由于血腦屏障作用， 造成屏障內(nèi)外胰島素濃度差， 使得胰島素較晚釋放至外周循環(huán)中發(fā)揮作用， 也使得移植物被排斥后仍能保持一定的胰島素作用濃度， 表現(xiàn)為血糖上升緩慢， 而稍微延遲反映排斥反應發(fā)生。 門靜脈組則血糖下降最快， 其下降曲線及上升曲線均很陡峭， 這與肝臟是胰島素的直接作用部位， 利于肝細胞攝取有關， 從這個意義上講， 如能改善肝臟內(nèi)胰島生存環(huán)境及其他干預措施能起有效作用(如重復性豬胰島移植、 誘導免疫耐受形成， 以及轉(zhuǎn)基因豬胰島、 微囊化豬胰島等)， 門靜脈途徑仍不失為有潛力的最好方法之一。作者單位： 430030武漢， 同濟醫(yī)科大學附屬同濟醫(yī)院器官移植研究所，第1作者現(xiàn)在同濟醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院泌尿外科參考文獻1Barker CF, Markmann JF, Naji A. Studies of privileged sites and islet transplantation. Transp Proc, 1991, 23:2138-2139.2London NJM. Human pancreatic islet isolation a