地塞米松對(duì)腦缺氧缺血新生大鼠bcl-x及bax基因表達(dá)的調(diào)節(jié)

1、    地塞米松對(duì)腦缺氧缺血新生大鼠bcl-x及bax基因表達(dá)的調(diào)節(jié)        【摘要】目的探討地塞米松(DEX)預(yù)處理對(duì)缺氧缺血(HI)新生大鼠腦保護(hù)作用的可能機(jī)制。方法通過建立新生大鼠缺氧缺血性腦病(HIE)動(dòng)物模型，應(yīng)用快速競爭性RT-PCR技術(shù)，分別對(duì)HI、DEX預(yù)處理后于HI、缺氧結(jié)束后即刻予DEX、DEX加假手術(shù)、正常對(duì)照5組(每組40只鼠)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)側(cè)大腦組織中bcl-x (bcl-xl和bcl-xs)、bax mRNA的表達(dá)進(jìn)行半定量分析。結(jié)果腦HI后bc

2、l-xs、bax mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)，并在HI后24 h左右達(dá)高峰(bcl-xs 1.52±0.17, bax 1.43±0.17)，在腦HI后272 h，DEX預(yù)處理組bcl-xs 、bax mRNA的表達(dá)水平(bcl-xs 0.03±0.05 0.19±0.23，bax 0.02±0.030.13±0.21)顯著低于HI組(bcl-xs 0.14±0.061.52±0.17，bax 0.09±0.031.43±0.17)(P<0.01)，而HI后給予DEX組其bcl-xs 、bax

3、 mRNA的表達(dá)量(bcl-xs 0.13±0.071.53±0.18；bax 0.07±0.051.47±0.10)與HI組之間的差異無顯著性(P>0.05)。DEX及HI對(duì)bcl-xl mRNA的表達(dá)無明顯影響。結(jié)論腦HI可誘導(dǎo)bcl-xs、bax mRNA過表達(dá)，這種過表達(dá)在腦HI后細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程中可能起著重要作用。DEX預(yù)處理可通過抑制bcl-xs、bax mRNA的過表達(dá)起到抗細(xì)胞凋亡的作用。【關(guān)鍵詞】腦缺氧；腦缺血；地塞米松；bcl-x；bax The regulatory effects of dexamethasone on m

4、RNA expression of bcl-x and bax in neonatal rats with cerebral hypoxia-ischemiaZHOU Wei，WU Shengmei，CHEN Huijin（Xinhua Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai Institute of Pediatrics, Shanghai 200092, China）【Abstract】ObjectiveTo explore the possible mechanisms of the neuroprotective e

5、ffect of dexamethasone(DEX) on neonatal rats with cerebral hypoxia-ischemia. MethodsThe rapid competitive reverse transcriptase-PCR was used to analyze the expression of bcl-x (bcl-xl and bcl-xs) and bax mRNA at ipsilateral cerebral hemisphere semi-quantitatively in the neonatal rat model of hypoxia

6、-ischemia(HI group), DEX treatment prior to hypoxia-ischemia(DH group), DEX treatment immediately following hypoxia-ischemia(HD group), DEX treatment prior to sham operation and normal controls, respectively. ResultsThe expressions of bcl-x and bax mRNA in the ipsilateral hemisphere following cerebr

7、al hypoxia-ischemia increased significantly, and reached the peak level at 24 h (bcl-x was 1.52±0.17 and bax was 1.43±0.17). During 2 h to 72 h following hypoxia-ischemia, the expressions of bcl-x and bax mRNA in DH group (bcl-xs were significantly lower than those in HI group (bcl-xs: 0.0

8、3±0.05 0.19±0.23 versus 0.14±0.061.52±0.17, and bax: 0.02±0.030.13±0.21 versus 0.09±0.031.43±0.17, respectively, P<0.01). While there were no significant differences in the expressions of bcl-xs and bax mRNA between HD group (0.13±0.071.53±0.18 an

9、d 0.07±0.051.47±0.10, respectively) and HI group (P>0.05). DEX and HI had no evident effect on the expression of bcl-x mRNA. ConclusionCerebral HI could induce the overexpressions of bax and bcl-x mRNA, which could play an important role in the regulation of apoptosis following cerebral

10、 HI. Pretreatment with DEX could exert the anti-apoptotic role by the down-regulation of bax and bcl-xs gene expressions.【Key words】Cerebral anoxia;Cerebral ischemia;Dexamethasone; Bcl-x; Bax有資料表明，地塞米松(dexamethasone, DEX)預(yù)處理可以減少新生動(dòng)物腦缺氧缺血(hypoxia ischemia, HI) 后所致的細(xì)胞凋亡。由于細(xì)胞凋亡受多種基因的調(diào)控，在哺乳動(dòng)物中bcl-2 基因家族

11、及其編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞凋亡調(diào)控過程中起著重要作用。因此,本研究擬通過快速競爭性RT-PCR技術(shù)，探討DEX對(duì)HI后新生大鼠腦內(nèi)bcl-2基因家族中bcl-x、 bax mRNA表達(dá)的影響，以期闡明DEX預(yù)處理對(duì)HI新生大鼠(簡稱鼠)腦保護(hù)作用的可能機(jī)制。材料和方法一、鼠腦HI動(dòng)物模型的制作和分組參照Rice等1方法，將生后7天的SD大鼠(購自中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)取仰臥位，頸正中切口，游離右側(cè)頸總動(dòng)脈并結(jié)扎，縫合切口后置于2 000 ml密閉容器，該容器置于37水浴中。以12 L/min的速度輸入含8氧氣、92氮?dú)獾幕旌蠚怏w，持續(xù)2.5 h。將200只鼠隨機(jī)分為5組(每組40只)：(1)

12、HI組；(2)預(yù)給藥組(即腹腔注射DEX后12 h左右予HI);(3)后給藥組(即缺氧結(jié)束后即刻予腹腔注射DEX)；(4)假手術(shù)給藥組(即僅作頸正中切口，游離右側(cè)頸總動(dòng)脈，但不結(jié)扎，假手術(shù)前注射DEX)；(5)正常對(duì)照組。分別于缺氧結(jié)束后不同時(shí)間點(diǎn)(假手術(shù)給藥組及正常對(duì)照組于相對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn))0、2、6、12、24、48、72 h及7 d斷頸處死(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只)。自丘腦中1/3水平取HI側(cè)(右側(cè))大腦半球組織約50 mg，置-80冰箱備用。DEX劑量為0.5 mg/kg，對(duì)照組注射0.9%氯化鈉注射液。二、引物的設(shè)計(jì)與合成從基因文庫中查到大白鼠bcl-x和bax基因cDNA序列，應(yīng)用Oligo

13、 5.0軟件程序設(shè)計(jì)上、下游引物，另設(shè)計(jì)一個(gè)下游競爭引物(包含下游引物另加若干個(gè)堿基序列)。bcl-x引物：上游 5ATCAATGGCAACCCATCCT-GGCACC3， 下游5TTGAAACGCTCCTGGCCTTTCCG-GC3；bcl-x內(nèi)參照引物：上游同bcl-x 引物，下游5 TTGAAACGCTCCTGGCCTTTCCGGCTCACTGAATGCTC-TCCGGTACCGC3；bax 引物：上游5ATCCAGGATC-GAGCAGGGAGGATGG3，下游5AGATGGTCACTGT-CTGCCATGTGGG3；bax內(nèi)參照引物：上游同bax 引物；下游5AGATGGTCACTG

14、TCTGCCATGTGGGCTGCC-ACCCGGAAGAAGACCTCTC3。bcl-x擴(kuò)增的目的片段有2個(gè)，即長片斷bcl-xl(482 bp)和短片斷bcl-xs (293 bp)，競爭片段長度為196 bp。Bax擴(kuò)增的目的片段長度為436 bp，競爭片段為224 bp。引物由美國Cybersyn生物工程公司合成。三、特定競爭性內(nèi)參照 (internal standard, IS)的制備制備方法參照文獻(xiàn)2。利用HI后6 h的鼠腦組織標(biāo)本提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用bcl-x或bax各自的內(nèi)參照引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳膠回收；再利用bcl-x或bax引物對(duì)稀釋后的回

15、收產(chǎn)物進(jìn)行第2次PCR擴(kuò)增，以提高純度、增加得率。電泳、回收后定量。制備IS后用不同稀釋度的IS與一定量的目的cDNA競爭，以選擇IS的最佳競爭濃度。四、快速競爭性逆轉(zhuǎn)錄PCR采用上海華舜生物工程公司生產(chǎn)的柱離心式組織/細(xì)胞RNA抽提試劑盒提取RNA，PE Lamda 10紫外/可見光分光光度計(jì)定量及電泳確定RNA質(zhì)量。取2 g總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。取3 l 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)行PCR擴(kuò)增。總反應(yīng)體系為25 l， 其中4×10 nmol/L dNTP 1 l，12.5 pmol 的引物各1 l，Taq DNA聚合酶1 U， bcl-x內(nèi)參照為

16、1 fg、bax內(nèi)參照為2.5 fg。五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。采用Kruskai-Wallis秩和檢驗(yàn)，用Statistica 5.0 軟件進(jìn)行。結(jié)果一、特定競爭性內(nèi)標(biāo)量的確定選擇目的條帶與競爭條帶均較明顯的電泳泳道含量(bcl-x為1 fg；bax 為2.5 fg), 即為競爭水平。二、HI后鼠腦內(nèi)bcl-x、bax基因表達(dá)動(dòng)態(tài)變化正常情況下，鼠腦內(nèi)bcl-xs和bax mRNA的表達(dá)一般低于可檢測水平。HI可誘導(dǎo)其表達(dá)增加。HI后6 h, 實(shí)驗(yàn)側(cè)(HI側(cè))腦bax和 bcl-xs mRNA的表達(dá)開始明顯增強(qiáng)，24 h達(dá)高峰，此后逐漸下降，7 d時(shí)其

17、表達(dá)已低于可檢測水平(表1)。而正常情況下bcl-xl mRNA在鼠腦內(nèi)即有很強(qiáng)的表達(dá)(2.8±0.8)，HI對(duì)其表達(dá)無明顯影響。三、DEX對(duì)bcl-x、bax基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用正常對(duì)照組及假手術(shù)給藥組鼠腦內(nèi)bcl-xs、bax mRNA的表達(dá)均低于可檢測水平。預(yù)給藥組其腦內(nèi)bcl-xs 或bax mRNA的表達(dá)在2、6、12、24、48、72 h等觀察點(diǎn)較HI組均呈明顯下降或幾乎完全被抑制(P<0.01)。而后給藥組其腦內(nèi)bax和 bcl-xs mRNA 的表達(dá)與HI組差異無顯著性(P>0.05)。在腦HI后7d時(shí)各組bax和 bcl-xs mRNA的表達(dá)均已低于可檢測

18、水平(表1)。Bcl-xl mRNA則在各組均有較強(qiáng)表達(dá)，其在各組各觀察點(diǎn)表達(dá)之間的差異均無顯著性(P>0.05, 數(shù)據(jù)未顯示)。表1不同處理組大鼠在腦HI后不同時(shí)間腦內(nèi) bcl-xs, bax mRNA的相對(duì)表達(dá)量(±s,fg/fg，n=5)缺氧缺血時(shí)間bcl-xs mRNAbax mRNAZ組J組HI組預(yù)給藥組后給藥組Z組J組HI組預(yù)給藥組后給藥組0 h000.08±0.0300.08±0.03000002 h000.14±0.060.03±0.05*0.13±0.07000.18±0.060.03±0.

19、050.19±0.076 h000.56±0.110.09±0.100.57±0.10000.47±0.140.08±0.100.47±0.1412 h001.17±0.310.19±0.231.21±0.28000.92±0.180.08±0.090.89±0.1724 h001.52±0.170.15±0.221.53±0.18001.43±0.170.13±0.211.47±0.1048 h001.0

20、5±0.260.06±0.071.05±0.26000.61±0.100.12±0.140.55±0.1372 h000.57±0.120.08±0.110.55±0.13000.09±0.030.02±0.030.07±0.057 d0000000000注：Z組代表正常對(duì)照組，J組代表假手術(shù)給藥組。自272 h，預(yù)給藥組與HI組比較，P<0.01 (*P<0.05); 預(yù)給藥組與后給藥組比較 P<0.01 (*P<0.05); HI組與后給藥組比較

21、P>0.05 討論新生動(dòng)物腦HI后可引起許多基因表達(dá)的改變，從而引發(fā)一系列細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，腦HI可誘導(dǎo)bcl-xs及bax mRNA過表達(dá)，二者都是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因。而且bcl-xs及bax mRNA過表達(dá)的高峰時(shí)相均位于腦HI后24 h左右。我們另外的研究以及國內(nèi)外其他一些研究均與上述bcl-xs和 bax mRNA的表達(dá)高峰時(shí)相基本吻合。提示bax, bcl-xs mRNA 的過表達(dá)在腦HI后細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程中起著重要作用。不過，Dixon等3的研究顯示，腦缺血成年大鼠雖然其bcl-x mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，但其翻譯產(chǎn)物bcl-xs與bcl-xl的比率甚低，說明bc

22、l-xs蛋白合成量很少。因此，HI后bcl-xs基因及其編碼的蛋白質(zhì)在腦細(xì)胞凋亡調(diào)控過程中起到的作用可能是有限的。有人認(rèn)為bcl-xl / bax的比值在確定生后中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元凋亡閥方面起著關(guān)鍵作用4。本研究結(jié)果顯示，HI對(duì)bcl-xl mRNA表達(dá)無影響，但HI誘導(dǎo)了bax mRNA表達(dá)的增強(qiáng)，因而bcl-xl / bax的比值降低，導(dǎo)致了腦細(xì)胞的凋亡，與上述觀點(diǎn)相一致。DEX為一人工合成的糖皮質(zhì)激素，近年來一些實(shí)驗(yàn)研究表明，DEX預(yù)處理對(duì)HI新生動(dòng)物具有神經(jīng)保護(hù)作用，這種作用存在時(shí)間依賴性，即在HI前448 h內(nèi)給予DEX具有神經(jīng)保護(hù)作用，而在HI前3 h內(nèi)及發(fā)生HI后應(yīng)用DEX則無效

23、5。其作用機(jī)制尚不清楚，但這種時(shí)間依賴性提示DEX的作用可能與基因水平的調(diào)控有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，DEX預(yù)處理可明顯抑制HI對(duì)bax、bcl-xs mRNA過表達(dá)的誘導(dǎo)。而在HI后給予DEX則未能起到同樣的作用。即刻早期基因c-jun可作為一種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)靶基因的表達(dá)，在對(duì)其后續(xù)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)時(shí)，可能會(huì)觸發(fā)死亡基因的轉(zhuǎn)錄。c-jun是一種重要的即刻早期基因，已有研究認(rèn)為它在神經(jīng)元凋亡中起著重要作用6。Macaya等7研究表明, 腦HI能誘導(dǎo)即c-jun過表達(dá)，而DEX預(yù)處理則能抑制HI對(duì)其的誘導(dǎo)，因此造成DEX作用的時(shí)間依賴性的原因也許可以解釋為：腦HI誘導(dǎo)c-jun等即刻早期基因

24、的過表達(dá)，繼而觸發(fā)死亡基因bax和bcl-xs等的轉(zhuǎn)錄，從而啟動(dòng)程序化細(xì)胞死亡過程。DEX預(yù)處理可抑制HI對(duì)c-jun等的誘導(dǎo)，故不能觸發(fā)bax和bcl-xs等的轉(zhuǎn)錄，而使細(xì)胞免遭凋亡。但是，一旦HI誘導(dǎo)了c-jun等的表達(dá)，此時(shí)再用DEX則不能阻斷程序化細(xì)胞死亡，因而不能起到神經(jīng)保護(hù)作用。另外，電生理研究顯示糖皮質(zhì)激素可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元活性。Liu等也觀察到，經(jīng)DEX預(yù)處理的鼠HI后，其缺血側(cè)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)神經(jīng)元成熟及髓鞘形成均延遲，但不久即恢復(fù)至正常水平，認(rèn)為DEX對(duì)HI鼠的保護(hù)作用乃是由于暫時(shí)抑制神經(jīng)元的成熟所致5。因此，推測DEX對(duì)bax和bcl-xs基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，也可能是神經(jīng)元活性

25、受到了DEX的暫時(shí)抑制，因而未能對(duì)HI產(chǎn)生應(yīng)答，沒有誘導(dǎo)bax和bcl-xs mRNA的過表達(dá), 致使細(xì)胞免于凋亡。 （本文編輯：徐福蘭）作者單位：周偉（200092 上海第二醫(yī)科大學(xué)新華醫(yī)院 上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所，現(xiàn)在廣州，第一軍醫(yī)大學(xué)附屬珠江醫(yī)院兒科 5100282）吳圣楣（200092 上海第二醫(yī)科大學(xué)新華醫(yī)院 上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所）陳惠金（200092 上海第二醫(yī)科大學(xué)新華醫(yī)院 上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所）參考文獻(xiàn)1，Rice JE, Vannucci RC, Brierley JB. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Ann Neurol, 1981, 9:131-141.2，Jiang YH, Davidson LA, Lupton JR, et al. Rapid competitive PCR deter