高速逆流色譜簡(jiǎn)介與應(yīng)用

1、高速逆流色譜高速逆流色譜 1 1 2高速逆流色譜簡(jiǎn)介高速逆流色譜簡(jiǎn)介高速逆流色譜的應(yīng)用高速逆流色譜的應(yīng)用一、概述一、概述 高速逆流色譜（高速逆流色譜（HSCCCHSCCC）是一種連續(xù)高效的）是一種連續(xù)高效的液液- -液分配色譜分離技術(shù)液分配色譜分離技術(shù)。該技術(shù)不需要。該技術(shù)不需要固體支撐固體支撐體體，主要根據(jù)物質(zhì)在，主要根據(jù)物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)的不同對(duì)物兩相中分配系數(shù)的不同對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離質(zhì)進(jìn)行分離，相對(duì)其他常用色譜（如柱色譜、高，相對(duì)其他常用色譜（如柱色譜、高效液相色譜等）來說，特點(diǎn)是效液相色譜等）來說，特點(diǎn)是無不可逆吸附無不可逆吸附和和回回收收率高率高，特別適合于，特別適合于天然活性成分天然

2、活性成分的分離。的分離。 HSCCC HSCCC技術(shù)最早是由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院技術(shù)最早是由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院Ito博博士士研制應(yīng)用，我國(guó)對(duì)研制應(yīng)用，我國(guó)對(duì)HSCCCHSCCC技術(shù)應(yīng)用較早，技術(shù)應(yīng)用較早，HSCCCHSCCC技術(shù)發(fā)展十分迅速，在過去技術(shù)發(fā)展十分迅速，在過去2030年中，年中，出現(xiàn)了一系列新型的分離技術(shù)，積累了大量的出現(xiàn)了一系列新型的分離技術(shù)，積累了大量的科研成果。科研成果。二二、HSCCC色譜色譜工作原理工作原理 HSCCC HSCCC色譜包括色譜包括儲(chǔ)液罐儲(chǔ)液罐、泵泵、螺旋管分離螺旋管分離柱柱、檢測(cè)器檢測(cè)器、色譜工作站色譜工作站或或數(shù)據(jù)采集軟件數(shù)據(jù)采集軟件或或記記錄儀錄儀以及以及餾分收

3、集器餾分收集器等部分。等部分。 選擇溶劑體系選擇溶劑體系平衡平衡選擇固定相選擇固定相充滿螺旋管柱充滿螺旋管柱高速旋轉(zhuǎn)螺旋管高速旋轉(zhuǎn)螺旋管泵入泵入流動(dòng)相流動(dòng)相流動(dòng)相流出，注入待分離的樣品流動(dòng)相流出，注入待分離的樣品收集餾分收集餾分HSCCC的工作流程的工作流程http:/ 如下圖所示，螺旋柱中注滿差不多相等體積的兩相溶劑（見右側(cè)試管），在螺旋柱的勻速轉(zhuǎn)動(dòng)下兩相溶劑受到“阿基米德螺旋力”的作用，競(jìng)爭(zhēng)性地朝首端移動(dòng)。不久，兩相在螺旋管地首端建立一種流體動(dòng)力平衡，按一定比例共存，而這種情況發(fā)生在每一圈螺旋柱內(nèi)。并且任何一相的超量都會(huì)被推向螺旋管的尾端一側(cè)。固定相的保留固定相的保留利用螺旋管的方向性和同

4、步行星式運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的二維利用螺旋管的方向性和同步行星式運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的二維 離心力場(chǎng)形成的離心力場(chǎng)形成的單向性流體動(dòng)力學(xué)平衡單向性流體動(dòng)力學(xué)平衡（HDES）從而實(shí)現(xiàn)流動(dòng)相高速移動(dòng)時(shí)固定相的保留從而實(shí)現(xiàn)流動(dòng)相高速移動(dòng)時(shí)固定相的保留以以1000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/ /分的速率分的速率進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，在二維力進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，在二維力場(chǎng)的作用下分離管柱場(chǎng)的作用下分離管柱內(nèi)混合和傳遞的頻率內(nèi)混合和傳遞的頻率可達(dá)到可達(dá)到1717次次/S/S，從而，從而實(shí)現(xiàn)高效的分離實(shí)現(xiàn)高效的分離混合區(qū)：混合區(qū)：在靠近離心軸在靠近離心軸心大約有四分之一的區(qū)心大約有四分之一的區(qū)域，兩相的激烈混合域，兩相的激烈混合靜置區(qū)：靜置區(qū)：兩相溶劑分成兩相溶劑分成兩層，

5、重相在外部，輕兩層，重相在外部，輕相在內(nèi)部相在內(nèi)部分分離離效效果果溶劑系統(tǒng)溶劑系統(tǒng)固定相固定相流動(dòng)相流動(dòng)相洗脫方式、流動(dòng)相的流速洗脫方式、流動(dòng)相的流速儀器的旋轉(zhuǎn)方向和轉(zhuǎn)速儀器的旋轉(zhuǎn)方向和轉(zhuǎn)速樣品濃度和進(jìn)樣方式樣品濃度和進(jìn)樣方式柱溫等柱溫等檢測(cè)器檢測(cè)器紫外紫外- -可見光檢測(cè)器可見光檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器質(zhì)譜檢測(cè)器等質(zhì)譜檢測(cè)器等http:/ 1 溶劑體系的種類溶劑體系的種類弱極性溶劑體系弱極性溶劑體系中等極性溶劑體系中等極性溶劑體系強(qiáng)極性溶劑體系強(qiáng)極性溶劑體系兩相兩相由由正己烷和水正己烷和水組成，可用組成，可用甲醇、乙醇、醋酸甲醇、乙醇、醋酸乙酯乙酯等來調(diào)節(jié)溶劑系統(tǒng)的極性。等來調(diào)

6、節(jié)溶劑系統(tǒng)的極性。典型的溶劑體系有典型的溶劑體系有：正己烷正己烷- -醋酸乙酯醋酸乙酯- -乙醇乙醇- -水水 正己烷正己烷- -醋酸乙酯醋酸乙酯- -甲醇甲醇- -水水中等極性溶劑體系的兩相由中等極性溶劑體系的兩相由氯仿氯仿和和水水組成，可以加入組成，可以加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯甲醇、乙醇、醋酸乙酯等來調(diào)節(jié)溶劑系統(tǒng)的極性。等來調(diào)節(jié)溶劑系統(tǒng)的極性。適合于適合于黃酮類、蒽醌類、香豆素黃酮類、蒽醌類、香豆素和一些極性較大的和一些極性較大的木木脂素和萜類脂素和萜類的分離。的分離。典型的溶劑體系是典型的溶劑體系是氯仿氯仿- -甲醇甲醇- -水水（4 4：3 3：2 2）強(qiáng)極性溶劑體系的強(qiáng)極性溶劑體系的

7、兩相兩相基本物質(zhì)是基本物質(zhì)是正丁醇和水正丁醇和水，可以，可以加入加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯甲醇、乙醇、醋酸乙酯等溶劑來調(diào)節(jié)溶劑系統(tǒng)的等溶劑來調(diào)節(jié)溶劑系統(tǒng)的極性，也可以在氯仿水體系中調(diào)節(jié)極性，也可以在氯仿水體系中調(diào)節(jié)pHpH值值來增大極性來增大極性, ,或或在異丁基甲醚水體系中加入在異丁基甲醚水體系中加入適量的酸和堿適量的酸和堿. .適合于極性適合于極性很強(qiáng)的生物堿類化合物的分離。很強(qiáng)的生物堿類化合物的分離。典型的溶劑體系典型的溶劑體系: :氯仿氯仿- -甲醇甲醇-HCl-HCl異丁基甲醚異丁基甲醚- -水水（有機(jī)相加三乙胺，水相加鹽酸）（有機(jī)相加三乙胺，水相加鹽酸）2 2 溶劑體系選擇的步驟溶劑

8、體系選擇的步驟（1 1）預(yù)測(cè)要分離物質(zhì)的極性，粗選一個(gè)溶劑體系）預(yù)測(cè)要分離物質(zhì)的極性，粗選一個(gè)溶劑體系；（2 2）取少量樣品于上下相）取少量樣品于上下相各各2 2毫升毫升的溶劑體系中，用的溶劑體系中，用TLCTLC進(jìn)行檢驗(yàn)，可加入進(jìn)行檢驗(yàn)，可加入甲醇、乙醇、醋酸乙酯甲醇、乙醇、醋酸乙酯等來調(diào)節(jié)等來調(diào)節(jié)溶劑體系的極性，直到樣品在上下相中的分配比溶劑體系的極性，直到樣品在上下相中的分配比K K為為0.52為止；為止；（3 3）用）用HPLCHPLC測(cè)定測(cè)定K K值；值；（4 4）用）用分析型分析型HSCCCHSCCC進(jìn)行預(yù)分離，再用進(jìn)行預(yù)分離，再用制備型高速逆制備型高速逆流色譜流色譜進(jìn)行分離。進(jìn)行

9、分離。（1 1）溶劑不造成樣品的分解或變性溶劑不造成樣品的分解或變性；（2 2）樣品在溶劑中有足夠高的溶解度樣品在溶劑中有足夠高的溶解度；（3 3）樣品在溶劑系統(tǒng)中有合適的分配系數(shù)樣品在溶劑系統(tǒng)中有合適的分配系數(shù) 值值；（固定相為管柱總體積的；（固定相為管柱總體積的50%50%以以上，分配系數(shù)為上，分配系數(shù)為0.52）（4 4）固定相能實(shí)現(xiàn)足夠高的保留固定相能實(shí)現(xiàn)足夠高的保留。3 3 選擇溶劑時(shí)應(yīng)注意選擇溶劑時(shí)應(yīng)注意生物堿生物堿氯仿氯仿- -甲醇甲醇-NaH-NaH2 2POPO4 4溶液溶液(pH = 4)(pH = 4)溶劑體系溶劑體系氯仿氯仿- -甲醇甲醇- -鹽酸體系鹽酸體系異丁基甲醚

10、異丁基甲醚- -四氫呋喃四氫呋喃- -水體系水體系異丁基甲醚異丁基甲醚- -水體系水體系正己烷正己烷- -乙醇乙醇- -水體系水體系正己烷正己烷- -醋酸乙酯醋酸乙酯- -水水正己烷正己烷- -醋酸乙酯醋酸乙酯- -甲醇甲醇- -水水4 4 不同物質(zhì)的溶劑體系不同物質(zhì)的溶劑體系黃黃酮酮類類化化合合物物正己烷正己烷- -醋酸乙酯醋酸乙酯- -甲醇甲醇- -水水正丁醇正丁醇- -醋酸乙酯醋酸乙酯- -水水氯仿氯仿- -甲醇甲醇- -水水正己烷正己烷- -醋酸乙酯醋酸乙酯- -正丁醇正丁醇- -甲醇甲醇- -醋酸醋酸- -水水正己烷正己烷- -醋酸乙酯醋酸乙酯- -甲醇甲醇- -水水萜類萜類異辛烷異

11、辛烷- -乙酸乙酯乙酸乙酯- -甲醇甲醇- -水水異辛烷異辛烷- -甲醇甲醇- -水水氯仿氯仿- -甲醇甲醇- -水水木脂素和香豆素木脂素和香豆素氯仿氯仿- -甲醇甲醇- -水水正己烷正己烷- -乙睛乙睛- -醋酸乙酯醋酸乙酯- -水水正己烷正己烷- -甲醇甲醇- -水水氯仿氯仿- -甲醇甲醇- -水水高速逆流色譜技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域高速逆流色譜技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域1 高速逆流色譜在中藥現(xiàn)代化中的應(yīng)用高速逆流色譜在中藥現(xiàn)代化中的應(yīng)用2 高速逆流色譜在抗生素分離純化中的應(yīng)用高速逆流色譜在抗生素分離純化中的應(yīng)用3 高速逆流色譜在異構(gòu)體分離純化中的應(yīng)用高速逆流色譜在異構(gòu)體分離純化中的應(yīng)用4 高速逆流色譜在食品行

12、業(yè)中的應(yīng)用高速逆流色譜在食品行業(yè)中的應(yīng)用5 高速逆流色譜在化學(xué)合成中的應(yīng)用高速逆流色譜在化學(xué)合成中的應(yīng)用6 高速逆流色譜在生物領(lǐng)域中的應(yīng)用高速逆流色譜在生物領(lǐng)域中的應(yīng)用7 高速逆流色譜在發(fā)酵產(chǎn)物分離純化中的應(yīng)用高速逆流色譜在發(fā)酵產(chǎn)物分離純化中的應(yīng)用成藥質(zhì)量控制成藥質(zhì)量控制 指紋圖譜指紋圖譜指導(dǎo)原藥材種植指導(dǎo)原藥材種植/GAP基地建設(shè)基地建設(shè)單體化合物單體化合物用于制藥中間體的質(zhì)用于制藥中間體的質(zhì)量控制量控制 HSCCC在中藥中各類單體的制備均有應(yīng)用，經(jīng)在中藥中各類單體的制備均有應(yīng)用，經(jīng)過簡(jiǎn)單的前處理（提取、萃取或大孔樹脂柱）后過簡(jiǎn)單的前處理（提取、萃取或大孔樹脂柱）后直接上樣，一次分離就能得到

13、高純度和高得率的直接上樣，一次分離就能得到高純度和高得率的單體，已成為天然產(chǎn)物分離純化中有效的不可替單體，已成為天然產(chǎn)物分離純化中有效的不可替代的分離方法。代的分離方法。02040608010012014001234567891011121314Time (h)Absorbance (OD280nm)0102030400100200mAU (280nm)Time (min) 01020304004080120160mAU (280nm)Time (min) 0102030400100200mAU (280nm)Time (min) B1B2B305010015020025001234567891011121314Time (h)Absorbance (OD280nm)02040608010001234567891011121314Time (h)Absorbance (OD280nm)A1A2A3HSCCCHSCCC圖譜圖譜