elisa測(cè)抗原實(shí)驗(yàn)報(bào)告范文

1、elisa 測(cè)抗原實(shí)驗(yàn)報(bào)告范文一實(shí)驗(yàn)?zāi)康拿嘎?lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay 簡(jiǎn)稱ELISA是在免疫酶技術(shù)（immunoenzymatic techniques）的基礎(chǔ)上發(fā) 展起來的一種新型的免疫測(cè)定技術(shù)，ELISA程包括抗原（抗體）吸附 在固相載體上稱為包被，加待測(cè)抗體（抗原）, 再加相應(yīng)酶標(biāo)記抗體（抗原）,生成抗原（抗體）待測(cè)抗體（抗原）酶標(biāo)記抗體的復(fù)合物，再與該酶的底物反應(yīng)生成有色產(chǎn)物。借助分光光度計(jì)的光吸收計(jì)算抗體（抗原）的量。待測(cè)抗體（抗原）的定量與有色產(chǎn)生成 正比。二實(shí)驗(yàn)原理用于免疫酶技術(shù)的酶有很多，如過氧化物酶，堿性磷酸酯酶，BD半

2、乳糖甘酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酊酶，乙酰膽堿酯酶，6 磷酸葡萄糖脫氧酶等。常用于 ELISAI的酶有辣根過氧化物酶，堿性 磷酸酯酶等，其中尤以辣根過氧化物酶為多。由于酶摧化的是氧化還原反應(yīng)，在呈色后須立刻測(cè)定，否則空氣中的氧化作用使顏色加深，無法準(zhǔn)確地定量。辣根過氧化物酶（HRB是一種糖蛋白，每個(gè)分子含有一個(gè)氯化 血紅素（protonhemin）區(qū)作輔基。酶的濃度和純度常以輔基的含量 表示。氯化血紅素輔基的最大吸收峰是 403nm, HRP酶蛋白的最大吸 收峰是275nm,所以酶的濃度和純度計(jì)算式是（已知 HRP的A （1cm 403nm 1%） =25,式中1 %指HRP百分濃度為100ml含

3、酶蛋白1g, 即10mg/ml,所以，酶濃度以 mg/ml計(jì)算是HRP的A （1cm 403nm mg/ml=2.5） HRP純度（RZ）=A403nm/A275nm 純度 RZ（ Reinheit Zahl） 值越大說明酶內(nèi)所含雜質(zhì)越少。高純度 HRP的RZ值在3.0左右，最 高可達(dá)3.4。用于ELISA僉測(cè)的HRP的RZ值要求在3.0以上。ELISA勺基本原理有三條：（ 1）抗原或抗體能以物理性地吸附于固相載體表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫學(xué)活性；（ 2）抗原或抗體可通過共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其免疫學(xué)和酶學(xué)活性；（ 3）酶結(jié)合

4、物與相應(yīng)抗原或抗體結(jié)合后，可根據(jù)加入底物的顏色反應(yīng)來判定是否有免疫反應(yīng)的存在，而且顏色反應(yīng)的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成正比例的，因此， 可以按底物顯色的程度顯示試驗(yàn)結(jié)果。ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測(cè)定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認(rèn)為ELISA&具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來測(cè)定抗體，而且也可用于測(cè)定體液中的循環(huán)抗原，所以

5、也是一種早期診斷的良好方法。因此 ELISA&在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，可概括四個(gè)方面：1、免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。2、研究抗酶抗體的合成。3、顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng)。4、定量檢測(cè)體液中抗原或抗體成份?；痉椒ㄒ挥糜跈z測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法:1. 包被：用0.05M PH9軸碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白 質(zhì)含量為110區(qū)g/ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加 0.1ml, 4c 過夜。 次日， 棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3 次， 每次 3 分鐘。 （簡(jiǎn)稱洗滌，下同）。2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml 于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37孵育1 小時(shí)。然后洗滌。（同

6、時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔）。3. 加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37c孵育0.51小時(shí)，洗滌。4. 加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB 底物溶液0.1ml, 37c 1030分鐘。5. 終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M 硫酸0.05ml。6. 結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA僉測(cè)儀上， 于450nm （若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè) 各孔O D值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)

7、照 OD值的2.1倍，即為陽性?；痉椒ǘ糜跈z測(cè)未知抗體的間接法：用包被緩沖液將已知抗原稀釋至 110wg/ml,每孔加0.1ml,4c過夜。次日洗滌3次。；加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml 于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37c孵育1小時(shí),洗滌。（同時(shí)做空白、陰性及陽性孔對(duì)照）；于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml，37c孵育30-60分鐘，洗滌，最后一遍用DDW洗滌。；其余步驟同“雙抗體夾心法”的 4、 5、 6。（二） 酶與底物酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原, 半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是ELISAS敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反

8、應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物。免疫技術(shù)常用的酶及其底物1 終止劑為2mol/L H2SO42 * 終止劑為2 mol/L 檸檬酸，不同的底物有不同的終止劑?？纱呋铝蟹磻?yīng)：HRP+H2O2復(fù)合物 復(fù)合物+AH2過氧化物酶+H2O+A AH2為無色底物，供氫體；A 為有色產(chǎn)物。（三）ELISAS用的四種方法1直接法測(cè)定抗原將抗原吸附在載體表面；加酶標(biāo)抗體，形成抗原抗體復(fù)合物； 加底物。底物的降解量=抗原量。2間接法測(cè)定抗體將抗原吸附于固相載體表面；加抗體 , 形成抗原-抗體復(fù)合物；加酶標(biāo)抗體；加底物。測(cè)定底物的降解量=抗體量。3雙抗體夾心法測(cè)定抗原將抗原免疫第一種動(dòng)物獲得的抗體吸附于固相表面;加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物;加抗原免疫第二種動(dòng)物獲得的抗