豆油在紅霉素發(fā)酵中的作用及作用機(jī)制的研究

1、豆油在紅霉素發(fā)酵中的作用及作用機(jī)制的研究(1)作者：沈兆兵 陳國豪 陳長華 【摘要】 紅色糖多孢菌D在15L發(fā)酵罐的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和發(fā)酵過程中補(bǔ)加豆油，當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中豆油量加倍時(shí)，效價(jià)提高43.1%；發(fā)酵過程補(bǔ)加豆油罐的紅霉素效價(jià)、生產(chǎn)強(qiáng)度和Yp/s比不補(bǔ)豆油的分別提高了69.7%、69.6%和63.8%。通過實(shí)驗(yàn)測定發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程補(bǔ)加豆油后，異檸檬酸脫氫酶、甲基丙二酰CoA異構(gòu)酶的比活以及酮戊二酸的量均高于不補(bǔ)加豆油時(shí)的值，而琥珀酸的量低于不補(bǔ)加豆油時(shí)的值。推測豆油經(jīng)過紅色糖多孢菌代謝后進(jìn)入紅霉素合成的一條可能途徑：豆油經(jīng)過代謝后進(jìn)入TCA循環(huán)，并強(qiáng)化了TCA循環(huán)的通量，產(chǎn)生了大量酮戊二酸，再生

2、成琥珀酰CoA，琥珀酰CoA在甲基丙二酰CoA異構(gòu)酶的作用下生成甲基丙二酰CoA作為紅霉素合成的前體。 【關(guān)鍵詞】 豆油； 紅色糖多孢菌； 紅霉素發(fā)酵； 酮戊二酸； 甲基丙二酰CoA； 琥珀酸Study on effect of soybean oil on fermentation oferythromycin and its mechanismABSTRACT The final production of erythromycin by Saccharopolyspora erythraea was increased by 43.1% in 15L bioreactor with do

3、uble quantily of soybean oil into culture medium. The final production, production capacity and Yp/s of erythromycin were improved 69.7%, 69.6% and 63.8%, respectively, in 15L bioreactor with added soybean oil during fermentation. Specific activity of NADP isocitrate dehydrogenase, methylmalonyl coe

4、nzyme A mutase and the concentration of ketoglutaric acid were higher with added soybean oil than that not added, and the concentration of succinic acid was lower than that without added soybean oil. Therefore, the metabolic pathway from soybean oil to erythromycin was presumed as follows: soybean o

5、il is metabolized into TCA pathway to generate much ketoglutaric acid and then generate succinylCoA by strengthening TCA pathway, and the methylmalonylCoA is formed from succinylCoA by isomerization. Finally, methylmalonylCoA can be used as the precursor for the biosynthesis of erythromycin.KEY WORD

6、S Soybean oil; Saccharopolyspora erythraea; Erythromycin fermentation; ketoglutaric acid; MethylmalonylCoA; Succinic acid紅霉素的抗菌譜和青霉素相似，是治療耐藥性金葡菌和溶血性鏈球菌感染所引起疾病的首選藥物，臨床上可用于對青霉素過敏的患者1。紅霉素的生物合成是由1個(gè)丙酰輔酶A開始的，依次接上6個(gè)2甲基丙二酰輔酶A而形成的2。丙酰輔酶A的合成有2條途徑：丙酰輔酶A合成酶途徑；丙酸激酶與?；姿彷o酶A轉(zhuǎn)移酶偶聯(lián)也能夠催化丙酸生成丙酰輔酶A。紅色糖多孢菌合成紅霉素所必須的另一個(gè)前體

7、是甲基丙二酰輔酶A，合成甲基丙二酰輔酶A有3條途徑3：以三羧酸循環(huán)的琥珀酰輔酶A為底物的甲基丙二酰輔酶A變位酶和甲基丙二酰輔酶A消旋酶途徑4；以丙酰輔酶A為底物的甲基丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)羧基酶途徑5；丙酰輔酶A羧化酶途徑6。據(jù)報(bào)道，油能夠?yàn)榇蟓h(huán)內(nèi)酯類抗生素提供所需的前體，提高短鏈脂肪酸的合成。合成紅霉素過程中短鏈脂肪酸主要被短鏈脂肪酸激酶和?；姿彷o酶A轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)激活，同時(shí)還可以被酰基輔酶A合成酶激活， 丙酸激酶途徑是形成丙酰輔酶A的主要途徑3，因而油在紅霉素合成中有可能首先通過丙酰輔酶A途徑最終促進(jìn)紅霉素的合成。但Hunaiti4等又報(bào)道在紅霉素產(chǎn)生菌中甲基丙二酰輔酶A主要來源于三羧酸循環(huán)的琥珀酰

8、輔酶A，而不是丙酰輔酶A。本文在前人研究的搖瓶實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，重點(diǎn)在15L發(fā)酵罐中進(jìn)行添加豆油實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明豆油對紅霉素的效價(jià)及其它幾項(xiàng)指標(biāo)的提高的確有明顯作用；通過實(shí)驗(yàn)測定了發(fā)酵過程補(bǔ)加豆油對發(fā)酵液中有機(jī)酸以及相關(guān)酶活的影響，從理論上推測豆油對紅霉素生物合成的作用機(jī)制。1.材料與方法 1.1 菌株和培養(yǎng)基菌株 紅色糖多孢菌D，由本課題組自備。一級種子培養(yǎng)基(g/L) 淀粉30，糊精20，玉米漿20，黃豆餅粉15，硫酸銨1.4，硝酸銨1.0，氯化鈉2，碳酸鈣2，豆油4。二級種子培養(yǎng)基(g/L) 淀粉30，糊精20，玉米漿15，黃豆餅粉15，硫酸銨1.4，硝酸銨1.0，氯化鈉2，碳酸鈣2，豆油4。搖

9、瓶培養(yǎng)基(g/L)淀粉30，糊精20，玉米漿4，黃豆餅粉15，硫酸銨1.4，氯化鈉1.5，碳酸鈣4，豆油4。發(fā)酵罐培養(yǎng)基(g/L) 淀粉50，糊精20，玉米漿15，黃豆餅粉16，硫酸銨8，氯化鈉1.7，碳酸鈣30，豆油30。1.2 培養(yǎng)條件一級種子培養(yǎng) 在500ml搖瓶中加入60ml種子培養(yǎng)基，滅菌前pH調(diào)到7.2左右，滅菌后把斜面孢子挖塊1cm1cm左右接種在種子培養(yǎng)基內(nèi)，33培養(yǎng)4648h。二級種子培養(yǎng) 在500ml搖瓶中加入60ml種子培養(yǎng)基，滅菌前pH調(diào)到7.2左右，滅菌后把一級種子以5%的接種量接種在無菌培養(yǎng)基內(nèi)，33培養(yǎng)24h。搖瓶培養(yǎng) 在250ml搖瓶中加入25ml含不同量的豆油

10、的搖瓶培養(yǎng)基，以及不含豆油的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基滅菌前pH調(diào)到7.2，滅菌后把一級種子以10%的接種量接種在搖瓶培養(yǎng)基中，33培養(yǎng)144h。15L發(fā)酵罐培養(yǎng) 裝培養(yǎng)基10L，接種量為1000ml，培養(yǎng)基滅菌前pH調(diào)到7.2，發(fā)酵過程中溶解氧控制在30%左右，pH不低于6.8，33培養(yǎng)160h。1.3 分析方法還原糖和總糖的測定 取不同時(shí)期的培養(yǎng)液，用斐林法測定其中的還原糖和總糖?；瘜W(xué)效價(jià)的測定 采用磷酸法測定，紅霉素經(jīng)磷酸水解后成黃色，在485nm處有極大吸收值，可以定量測定。此方法主要用于發(fā)酵罐中發(fā)酵液的紅霉素效價(jià)的測定。生物效價(jià)的測定 采取計(jì)算抑菌圈法進(jìn)行定量測定。此方法主要用于搖瓶發(fā)酵中發(fā)酵液

11、的紅霉素效價(jià)測定。發(fā)酵液中豆油殘留量的測定 取不同時(shí)期的發(fā)酵液，用乙醚萃取法測定發(fā)酵液中殘留的豆油量。pH測定 發(fā)酵罐發(fā)酵過程中pH測定由發(fā)酵罐自帶的pH電極測定，搖瓶培養(yǎng)過程中的pH測定由pH測定儀測定。 本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不要用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。有機(jī)酸的測定 用Waters HPLC高效液相系統(tǒng)，Breeze Data Processor數(shù)據(jù)處理器，流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液，流速1ml/min，柱溫35，檢測波210nm。異檸檬酸脫氫酶、甲基丙二酰C

12、oA異構(gòu)酶的比活的測定7，8。2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加豆油對紅霉素發(fā)酵的影響(1)搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加豆油對紅霉素效價(jià)的影響 在搖瓶發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同量的豆油，每個(gè)條件接3個(gè)搖瓶，取平均效價(jià)，結(jié)果見Fig.1。Fig.1(a)結(jié)果顯示， 搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中豆油的添加量在00.8%范圍對效價(jià)沒有明顯的影響，F(xiàn)ig.1(b)顯示，當(dāng)豆油添加量高于0.8%后發(fā)酵效價(jià)明顯開始下降。量增大效價(jià)出現(xiàn)下降趨勢，有文獻(xiàn)報(bào)道5， 豆油的代謝可能通過三羧酸循環(huán)來促進(jìn)紅霉素的合成，因而加強(qiáng)豆油的代謝和三羧酸循環(huán)的通量必須考慮到O2的充分供給，使豆油代謝和三羧酸循環(huán)產(chǎn)生的大量NADH和FADH2能

13、夠順利進(jìn)入呼吸鏈進(jìn)行氧化磷酸化，以保證豆油代謝和三羧酸循環(huán)的通暢。(2)15L發(fā)酵罐的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加豆油對紅霉素效價(jià)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Tab.1。發(fā)酵結(jié)束后，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中豆油量加倍的罐效價(jià)比對照罐提高43.1%。2.2 在15L發(fā)酵罐中過程補(bǔ)加豆油對紅霉素發(fā)酵的影響Tab.2列出了在15L發(fā)酵罐規(guī)模培養(yǎng)的小試實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵過程補(bǔ)加豆油對紅霉素發(fā)酵幾項(xiàng)指標(biāo)的影響?？梢钥闯?，發(fā)酵過程補(bǔ)加豆油的發(fā)酵罐，紅霉素的效價(jià)、生產(chǎn)強(qiáng)度和Yp/s(消耗單位重量的基質(zhì)形成產(chǎn)物存量即基質(zhì)的產(chǎn)物得率系數(shù))明顯高于不補(bǔ)加豆油的發(fā)酵罐。從Tab.3可以看出，以上各項(xiàng)指標(biāo)的平均值，補(bǔ)加豆油的罐比不補(bǔ)加豆油的罐依次提高了69

14、.7%，69.6%和63.8%。這些指標(biāo)和2.1(2)的結(jié)果提示，在發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以及發(fā)酵過程補(bǔ)加適量豆油對紅霉素的生產(chǎn)具有促進(jìn)作用。2.3 過程補(bǔ)加豆油對異檸檬酸脫氫酶比活的影響三羧酸循環(huán)過程中，異檸檬酸氧化脫羧生成酮檬酸脫氫酶所催化。從Fig.2可以看出在整個(gè)發(fā)酵過程中，過程補(bǔ)加豆油對異檸檬酸脫氫酶的酶活具有促進(jìn)作用。 2.4 過程補(bǔ)加豆油對15L發(fā)酵罐中發(fā)酵液中的酮戊二酸量的影響從Fig.3曲線變化可以看出，過程補(bǔ)加豆油的發(fā)酵液中酮戊二酸的量從50h左右開始顯著增大，到80.3h達(dá)到最大值。在60140h補(bǔ)加豆油的發(fā)酵液中酮戊二酸的量明顯比不加豆油的量大。2.5 過程補(bǔ)加豆油對15L

15、發(fā)酵罐中發(fā)酵液中的琥珀酸量的影響從Fig.4中的曲線變化可以看出，在整個(gè)發(fā)酵過程中補(bǔ)豆油的發(fā)酵液中琥珀酸的量比不補(bǔ)油的發(fā)酵液中琥珀酸的量低，琥珀酸是琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)化的一條途徑，另一條途徑是異構(gòu)化生成甲基丙二酰輔酶A。2.6 過程補(bǔ)加豆油對甲基丙二酰CoA異構(gòu)酶比活的影響從Fig.5可以看出，過程補(bǔ)加豆油的發(fā)酵液中糖多孢鏈霉菌的胞內(nèi)甲基丙二酰CoA異構(gòu)酶活力隨著發(fā)酵的進(jìn)行明顯高于不補(bǔ)加豆油的過程。3 討論本文通過在紅霉素發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加豆油和發(fā)酵過程中進(jìn)行補(bǔ)加豆油實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)加豆油紅霉素效價(jià)有明顯的提高。發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補(bǔ)加豆油效價(jià)可以提高43.1%，發(fā)酵過程補(bǔ)加豆油可以使效價(jià)為進(jìn)一步推

16、測豆油對紅霉素合成的作用機(jī)制，實(shí)驗(yàn)中測定了發(fā)酵過程補(bǔ)加豆油對發(fā)酵液中酮戊二酸、琥珀酸含量的影響，以及補(bǔ)加豆油對異檸檬酸脫氫酶、甲基丙二酰CoA異構(gòu)酶比活的影響。發(fā)酵過程補(bǔ)加豆油，異檸檬酸脫氫酶比活得到提高，可以促進(jìn)異檸檬酸向酮戊二酸的轉(zhuǎn)化。測定結(jié)果顯示，酮戊二酸量的確高于不補(bǔ)豆油的發(fā)酵液；酮戊二酸量的增大導(dǎo)致琥珀酰輔酶A量的增加；測定發(fā)現(xiàn)補(bǔ)加豆油條件下琥珀酰輔酶A向琥珀酸轉(zhuǎn)化的通量變小，那么向甲基丙二酰CoA轉(zhuǎn)化的通量可能增大，實(shí)驗(yàn)測定發(fā)現(xiàn)甲基丙二酰CoA異構(gòu)酶比活在補(bǔ)加豆油條件下高，因此，琥珀酰輔酶A必然是更多的向甲基丙二酰CoA轉(zhuǎn)化。綜上分析得知，豆油經(jīng)過代謝后進(jìn)入TCA循環(huán)，強(qiáng)化了TCA

17、循環(huán)的通量，產(chǎn)生了大量酮戊二酸，再生成琥珀酰CoA，琥珀酰CoA在甲基丙二酰CoA異構(gòu)酶的作用下生成甲基丙二酰CoA作為紅霉素合成的前體?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Hamedi J, Malekzadeh F, Niknam V. Improved production of erythromycin by Saccharopolyspora erythraea by various plant oils J. Biotechnol Lett,2002,24(9):6972 李友榮，劉昌煥. 螺旋霉素的生物合成 IV.發(fā)酵過程中ATP與SPM生物合成的關(guān)系J. 中國抗生素雜志，l990，15(2)：83

18、3 Raczynska B K, Ruczaj Z, Sawnor K D. Limiting reactions in activation of acyl units in biosynthesis of macrolide antibiotics J. Antimicrob Agents Chemother,1973,3(2):1624 Hunaiti A A, Kolattkudy O E. Source of methylmalonylcoenzyme A for erythromycin synthesis J. Antimicrob Agents Chemother,1984,25(2):1735