蠟組織芯片制備技術的改良

1、蠟組織芯片制備技術的改良         【摘要】  目的:探討組織芯片制備方法以及相關技術改良，提高組織芯片制備的質量。方法:使用組織芯片空心蠟模一次性成型的模具，應用改良的組織芯片制備方法以及二次石蠟包埋技術，制作食管癌腫瘤組織芯片，常規(guī)病理石蠟切片制備組織芯片，觀察實驗結果。結果:組織芯片空心蠟模制備成功率達100%。所制備的組織芯片石蠟塊內組織芯切片平面整齊，無組織芯倒浮現(xiàn)象。組織芯片切片中組織芯片微組織片陣列整齊，無微組織片皺褶以及微組織片脫片現(xiàn)象。組織芯片常規(guī)HE染色后，經病理診斷醫(yī)生閱片，并

2、與各組織芯原供體石蠟標本常規(guī)病理HE染色片進行對照觀察，病理診斷結果一致。結論:改良的石蠟組織芯片制備技術簡單易學，操作流程容易掌握控制，提高了組織芯片制作的質量，有利于組織芯片技術的普及和推廣應用。 【關鍵詞】  組織芯片 技術改良 食管癌   組織芯片技術是繼基因芯片、蛋白質芯片后又一重要的生物芯片技術平臺，它是將數(shù)十個甚至數(shù)千個不同個體的組織標本集成在一張固相載體上所形成的組織微陣列1。組織芯片作為一種高通量、大樣本以及快速的生物分子水平研究分析工具，克服了傳統(tǒng)病理學方法和基因芯片技術中存在的某些缺陷，在醫(yī)學分子生物學研究領域發(fā)揮了愈來愈重要的作用，對于疾病

3、的分子診斷，預后指標和治療靶點的定位、抗體和藥物篩選等均有十分重要的實用價值，是疾病研究從基礎研究走向臨床應用研究重要的橋梁2-6。本研究針對現(xiàn)有組織芯片制備過程中存在的一些不足，如組織芯片空心蠟模制備操作程序較為繁瑣以及組織芯片石蠟塊二次包埋質量欠佳等，研究探索出一種行之有效的組織芯片制備方法，有利于組織芯片技術在醫(yī)學臨床、病理學等研究領域的進一步推廣應用。   1  材料和方法   1.1  材料  收集溫州醫(yī)學院附屬臺州醫(yī)院2004年9月至2007年2月間手術離體食管癌組織標本30例。對組織標本手術切緣至癌灶部全程黏膜

4、組織以及癌灶組織進行取材，分段處理。所有標本均經過10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片以及組織病理學檢查證實。每例食管癌組織標本均包含有：癌組織、不典型增生以及正常食管黏膜組織。石蠟切片機（leica RM 2135）、一次性石蠟切片刀片均購自德國徠卡公司。組織芯片制備系統(tǒng)（HT-1）購自朝陽恒泰科技發(fā)展有限責任公司。   1.2  制作組織芯片空心蠟模  利用組織芯片空心蠟模成型模具，一次成型制作組織芯片空心蠟模，具體操作將石蠟放入組織芯片制備系統(tǒng)熔蠟盤內加熱熔化，熔蠟盤內放入一片適當大小的硬質光面塑料薄板。將空心蠟模成型框大口朝下平放于熔蠟盤中的塑

5、料薄板上，調整熔蠟盤內石蠟的量，使熔化石蠟平面高出空心蠟模成型框約2 mm。將無刃陣列管針管口朝下放置于組織芯片制備系統(tǒng)加熱板上預熱（70 ）約10 min，平穩(wěn)垂直插入上述空心蠟模成型框。平穩(wěn)移開熔蠟盤，室溫冷卻石蠟數(shù)分鐘，熔蠟盤中石蠟呈半凝狀態(tài)時，下壓空心蠟模成型框活動頂板，使其貼近蠟模成型框。用小刀將空心蠟模成型框四周石蠟劃離，繼續(xù)室溫冷卻石蠟數(shù)分鐘，熔蠟盤中不再有任何能流動的液體狀石蠟。將熔蠟盤放回組織芯片制備儀上加溫數(shù)秒鐘，熔蠟盤底部石蠟開始熔化時迅速整體移除陣列管針、蠟模成型框、蠟模成型框內的蠟模。插入陣列管針針芯，推出并去除進入陣列管針內的石蠟，拔除陣列管針針芯，去除蠟模成型框外

6、部殘留的石蠟。使用組織芯片空心蠟模拔模裝置，均勻拔除陣列管針，去除蠟模成型框活動頂板以及蠟模成型框周邊殘留的石蠟。組織芯片空心蠟模制備完畢（見圖1）。組織芯片空心蠟模無需從蠟模成型框中取出。   1.3  制作組織芯片石蠟塊  目標組織定位：組織芯片供體蠟塊常規(guī)病理切片1張，片厚4m，常規(guī)HE染色后進行組織病理診斷閱片，在組織切片的指引下，對相應供體蠟塊進行目標組織定位標記。組織芯片蠟芯取材與點樣：將蠟塊放入適當溫度的熱水中預熱軟化片刻，應用組織芯片制備系統(tǒng)的芯片石蠟組織芯取樣器鉆取目標組織柱。目標組織柱逐一點樣于組織芯片空心蠟模中指定的位置。用實心單針

7、逐一將目標組織柱輕輕壓平，使其處于同一切片平面。將裝滿組織芯的蠟模平行移至一塊薄銅板上，加熱銅板數(shù)秒至貼近銅板的蠟模稍加熔化，迅速移除銅板，室溫冷卻數(shù)秒后去除銅板。二次包埋組織芯片石蠟塊：芯片組織面朝下，將點好樣的組織芯片蠟塊連同蠟模成型框放入盛有少量熔化石蠟的熔蠟盤中（熔化石蠟的深度約4 mm），數(shù)秒種后即可肉眼觀察到熔化的石蠟浸入到石蠟組織芯與蠟模孔的間隙。移除熔蠟盤，將塑料石蠟包埋盒放于蠟模成型框上，用小勺舀取熔化的石蠟倒入包埋盒中，室溫冷卻數(shù)分鐘，石蠟半凝狀態(tài)時用小刀劃離蠟模成型框周圍的石蠟。石蠟完全凝固后，復加熱熔蠟盤移除二次包埋好的組織芯片石蠟塊。去除蠟模成型框以及塑料石蠟包埋盒周

8、邊殘留石蠟，輪流加熱蠟模成型框四周邊框，使緊貼其邊框內側的石蠟熔化，取出成型的組織芯片石蠟塊（見圖1E）。   1.4  組織芯片切片制作及其應用  應用常規(guī)病理切片技術制作組織芯片石蠟切片，根據不同的研究目的，將組織芯片石蠟切片鋪于凈潔的或經過其他特殊處理的載玻片上（見圖2），繼續(xù)應用于常規(guī)HE染色、免疫組織化學染色以及原位雜交等細胞學或分子生物學檢測。   2  結果   2.1  組織芯片石蠟塊  所制備的組織芯片空心蠟模內無空泡，無裂痕，陣列孔均一整齊，無變形，空心蠟模制備過程

9、中無廢模出現(xiàn)，蠟模制備成功率達100%。所制備的組織芯片石蠟塊內組織芯切片平面整齊，無組織芯倒浮現(xiàn)象。   2.2  組織芯片  組織芯片肉眼觀察：石蠟切片中組織芯片微組織片陣列整齊，無微組織片皺褶以及微組織片脫片現(xiàn)象。組織芯片光學顯微鏡觀察：組織芯片常規(guī)HE染色后，經病理診斷醫(yī)生閱片，并與各組織芯原供體石蠟標本常規(guī)病理HE染色片進行對照觀察，病理診斷結果一致。表明所制作的組織芯片取材的準確性高，能滿足進一步的實驗研究需要。   3  討論   1986年Battifora首先在Lab Invest發(fā)表文

10、章，創(chuàng)立了組織芯片的雛形。1998年，Kononen等1首先提出了組織芯片（Tissue microarrays）的概念，即將數(shù)十個甚至數(shù)千個不同個體的組織標本集成在一張固相載體上形成組織微陣列生物芯片，此項研究突破了單一的腫瘤基因芯片表達譜研究模式，開始結合細胞和組織水平的高通量技術。醫(yī)學分子生物學研究領域于是有了一種新的高通量、大樣本的快速分析工具。組織芯片將眾多樣本放在同一切片上，同化了實驗條件，減少了因普通實驗方法中分批、分次實驗造成的實驗誤差，節(jié)約了實驗試劑和時間。根據不同的需要可設計單一腫瘤組織芯片、多腫瘤組織芯片、腫瘤進展組織芯片、腫瘤預后組織芯片等等不同類型的組織芯片。組織芯片

11、結合傳統(tǒng)病理學技術、免疫組織化學以及原位雜交等分子生物學技術9，10，廣泛地運用于生命科學研究領域，為基因功能研究走向臨床提供了捷徑。   組織芯片技術有省時、省力、低成本、高通量、大樣本等許多優(yōu)點，但實際制作組織芯片的過程中仍有許多有待改進之處，為此，研究者對組織芯片制備技術進行了不懈的探索和研究。本研究針對組織芯片制作過程中存在的缺陷，自行研制了組織芯片空心蠟模一次性成型模具，并對組織芯片制作技術進行改良，取得了良好的效果。   關于石蠟的選擇。石蠟黏稠度高、韌性強，常規(guī)打孔時不易斷裂，但拔除組織芯片陣列管針時阻力大，陣列管針不易拔除。反之，則容易將

12、實心空白蠟模打裂，產生廢模11，12。應用組織芯片空心蠟模一次性成型模具制備空心蠟模，無需先制備組織芯片實心空白蠟模再進行打孔處理，有效避免了上述因蠟模打孔操作引起的系列問題，使用不同熔點不同黏稠度的石蠟，均可順利制備完好的空心蠟模，成品合格率達100%。             關于二次石蠟包埋。組織芯片石蠟塊二次包埋成功與否，直接影響到組織芯片的質量。二次包埋成功的組織芯片石蠟塊，應具備如下特點：組織芯片蠟塊中，石蠟組織芯排列整齊，無移位現(xiàn)象；石蠟組織芯處于同一切片平面，無石蠟組織

13、芯倒浮現(xiàn)象；石蠟組織芯與空心蠟模融合良好，二者間不留有空隙，保證所制作的組織芯片中的微組織塊無皺褶以及脫片現(xiàn)象。采用普通灌注熔化石蠟的方法進行二次包埋13，熔化的石蠟很難有效灌注到石蠟組織芯與空心蠟模孔壁間的微小間隙，主要是因為熔化的石蠟接觸到處于室溫的蠟模時，往往未進入到石蠟組織芯與空心蠟?？妆陂g的微小間隙就已開始凝固，致使二次石蠟包埋有名無實。將熔化石蠟的溫度調高到足以能順利進入石蠟組織芯與空心蠟?？妆陂g的微小間隙的溫度，則熔化的石蠟即會將組織芯片石蠟塊整體熔化，致使組織芯片石蠟塊毀損。于是研究者研制出組織芯片二次包埋儀14，采用熔化石蠟灌注同時進行負壓抽吸的方法進行二次石蠟包埋。當石蠟組

14、織芯與空心蠟模間的間隙較大時，適當調整熔化石蠟的溫度和負壓壓力，采用該方法能取得較好的二次包埋效果；而當石蠟組織芯與空心蠟模間的間隙較小時，負壓吸引的作用極其有限，難以獲得良好的二次包埋效果。另有研究者建議將裝滿石蠟組織芯的組織芯片石蠟塊整體放入烤箱中逐漸緩慢升溫處理，使石蠟組織芯與組織芯片蠟模融合，達到二次包埋的目的11,13,15。其不足之處是溫度和時間較難控制，費時、費力，二次包埋效果亦不盡人意。   本研究將裝滿石蠟組織芯的組織芯片石蠟塊整體放入維持加溫的少量熔化石蠟中，直接將石蠟組織芯與組織芯片蠟模進行融合處理，取得了滿意的效果，而且實際操作過程簡單，容易掌握控制

15、。需要引起注意的是組織柱點樣完畢，一定要將組織柱逐一輕輕壓下，使其處于同一切片平面；二次石蠟包埋前，一定要進行簡單的組織柱防脫處理，以免在將裝滿石蠟組織芯的組織芯片石蠟塊整體轉入熔蠟盤中時，部分組織柱脫落。二次石蠟包埋時，同時將組織芯片石蠟塊與塑料包埋盒一同固定，有利于組織芯片蠟塊標記，并有利于常規(guī)石蠟切片時能將組織芯片石蠟塊直接固定到石蠟切片機上，便于切片?？傊?，本改良的石蠟組織芯片制備技術無需應用負壓吸引等特殊儀器設備，技術簡單易學，操作流程容易掌握控制，有利于組織芯片技術的普及和推廣應用?！緟⒖嘉墨I】  1 Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi

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