蠟組織芯片制備技術(shù)的改良

1、蠟組織芯片制備技術(shù)的改良         【摘要】  目的:探討組織芯片制備方法以及相關(guān)技術(shù)改良，提高組織芯片制備的質(zhì)量。方法:使用組織芯片空心蠟?zāi)Ｒ淮涡猿尚偷哪＞?，?yīng)用改良的組織芯片制備方法以及二次石蠟包埋技術(shù)，制作食管癌腫瘤組織芯片，常規(guī)病理石蠟切片制備組織芯片，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果:組織芯片空心蠟?zāi)Ｖ苽涑晒β蔬_(dá)100%。所制備的組織芯片石蠟塊內(nèi)組織芯切片平面整齊，無組織芯倒浮現(xiàn)象。組織芯片切片中組織芯片微組織片陣列整齊，無微組織片皺褶以及微組織片脫片現(xiàn)象。組織芯片常規(guī)HE染色后，經(jīng)病理診斷醫(yī)生閱片，并

2、與各組織芯原供體石蠟標(biāo)本常規(guī)病理HE染色片進(jìn)行對照觀察，病理診斷結(jié)果一致。結(jié)論:改良的石蠟組織芯片制備技術(shù)簡單易學(xué)，操作流程容易掌握控制，提高了組織芯片制作的質(zhì)量，有利于組織芯片技術(shù)的普及和推廣應(yīng)用。 【關(guān)鍵詞】  組織芯片 技術(shù)改良 食管癌   組織芯片技術(shù)是繼基因芯片、蛋白質(zhì)芯片后又一重要的生物芯片技術(shù)平臺，它是將數(shù)十個甚至數(shù)千個不同個體的組織標(biāo)本集成在一張固相載體上所形成的組織微陣列1。組織芯片作為一種高通量、大樣本以及快速的生物分子水平研究分析工具，克服了傳統(tǒng)病理學(xué)方法和基因芯片技術(shù)中存在的某些缺陷，在醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)研究領(lǐng)域發(fā)揮了愈來愈重要的作用，對于疾病

3、的分子診斷，預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)的定位、抗體和藥物篩選等均有十分重要的實(shí)用價值，是疾病研究從基礎(chǔ)研究走向臨床應(yīng)用研究重要的橋梁2-6。本研究針對現(xiàn)有組織芯片制備過程中存在的一些不足，如組織芯片空心蠟?zāi)Ｖ苽洳僮鞒绦蜉^為繁瑣以及組織芯片石蠟塊二次包埋質(zhì)量欠佳等，研究探索出一種行之有效的組織芯片制備方法，有利于組織芯片技術(shù)在醫(yī)學(xué)臨床、病理學(xué)等研究領(lǐng)域的進(jìn)一步推廣應(yīng)用。   1  材料和方法   1.1  材料  收集溫州醫(yī)學(xué)院附屬臺州醫(yī)院2004年9月至2007年2月間手術(shù)離體食管癌組織標(biāo)本30例。對組織標(biāo)本手術(shù)切緣至癌灶部全程黏膜

4、組織以及癌灶組織進(jìn)行取材，分段處理。所有標(biāo)本均經(jīng)過10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片以及組織病理學(xué)檢查證實(shí)。每例食管癌組織標(biāo)本均包含有：癌組織、不典型增生以及正常食管黏膜組織。石蠟切片機(jī)（leica RM 2135）、一次性石蠟切片刀片均購自德國徠卡公司。組織芯片制備系統(tǒng)（HT-1）購自朝陽恒泰科技發(fā)展有限責(zé)任公司。   1.2  制作組織芯片空心蠟?zāi)?#160; 利用組織芯片空心蠟?zāi)３尚湍＞撸淮纬尚椭谱鹘M織芯片空心蠟?zāi)?，具體操作將石蠟放入組織芯片制備系統(tǒng)熔蠟盤內(nèi)加熱熔化，熔蠟盤內(nèi)放入一片適當(dāng)大小的硬質(zhì)光面塑料薄板。將空心蠟?zāi)３尚涂虼罂诔缕椒庞谌巯灡P中的塑

5、料薄板上，調(diào)整熔蠟盤內(nèi)石蠟的量，使熔化石蠟平面高出空心蠟?zāi)３尚涂蚣s2 mm。將無刃陣列管針管口朝下放置于組織芯片制備系統(tǒng)加熱板上預(yù)熱（70 ）約10 min，平穩(wěn)垂直插入上述空心蠟?zāi)３尚涂?。平穩(wěn)移開熔蠟盤，室溫冷卻石蠟數(shù)分鐘，熔蠟盤中石蠟呈半凝狀態(tài)時，下壓空心蠟?zāi)３尚涂蚧顒禹敯澹蛊滟N近蠟?zāi)３尚涂?。用小刀將空心蠟?zāi)３尚涂蛩闹苁瀯濍x，繼續(xù)室溫冷卻石蠟數(shù)分鐘，熔蠟盤中不再有任何能流動的液體狀石蠟。將熔蠟盤放回組織芯片制備儀上加溫數(shù)秒鐘，熔蠟盤底部石蠟開始熔化時迅速整體移除陣列管針、蠟?zāi)３尚涂?、蠟?zāi)３尚涂騼?nèi)的蠟?zāi)?。插入陣列管針針芯，推出并去除進(jìn)入陣列管針內(nèi)的石蠟，拔除陣列管針針芯，去除蠟?zāi)３尚涂蛲?/p>

6、部殘留的石蠟。使用組織芯片空心蠟?zāi)０文Ｑb置，均勻拔除陣列管針，去除蠟?zāi)３尚涂蚧顒禹敯逡约跋災(zāi)３尚涂蛑苓厷埩舻氖灐＝M織芯片空心蠟?zāi)Ｖ苽渫戤叄ㄒ妶D1）。組織芯片空心蠟?zāi)o需從蠟?zāi)３尚涂蛑腥〕觥?#160;  1.3  制作組織芯片石蠟塊  目標(biāo)組織定位：組織芯片供體蠟塊常規(guī)病理切片1張，片厚4m，常規(guī)HE染色后進(jìn)行組織病理診斷閱片，在組織切片的指引下，對相應(yīng)供體蠟塊進(jìn)行目標(biāo)組織定位標(biāo)記。組織芯片蠟芯取材與點(diǎn)樣：將蠟塊放入適當(dāng)溫度的熱水中預(yù)熱軟化片刻，應(yīng)用組織芯片制備系統(tǒng)的芯片石蠟組織芯取樣器鉆取目標(biāo)組織柱。目標(biāo)組織柱逐一點(diǎn)樣于組織芯片空心蠟?zāi)Ｖ兄付ǖ奈恢?。用?shí)心單針

7、逐一將目標(biāo)組織柱輕輕壓平，使其處于同一切片平面。將裝滿組織芯的蠟?zāi)Ｆ叫幸浦烈粔K薄銅板上，加熱銅板數(shù)秒至貼近銅板的蠟?zāi)Ｉ约尤刍?，迅速移除銅板，室溫冷卻數(shù)秒后去除銅板。二次包埋組織芯片石蠟塊：芯片組織面朝下，將點(diǎn)好樣的組織芯片蠟塊連同蠟?zāi)３尚涂蚍湃胧⒂猩倭咳刍灥娜巯灡P中（熔化石蠟的深度約4 mm），數(shù)秒種后即可肉眼觀察到熔化的石蠟浸入到石蠟組織芯與蠟?zāi)？椎拈g隙。移除熔蠟盤，將塑料石蠟包埋盒放于蠟?zāi)３尚涂蛏希眯∩滓ㄈ∪刍氖灥谷氚窈兄?，室溫冷卻數(shù)分鐘，石蠟半凝狀態(tài)時用小刀劃離蠟?zāi)３尚涂蛑車氖?。石蠟完全凝固后，?fù)加熱熔蠟盤移除二次包埋好的組織芯片石蠟塊。去除蠟?zāi)３尚涂蛞约八芰鲜灠窈兄?/p>

8、邊殘留石蠟，輪流加熱蠟?zāi)３尚涂蛩闹苓吙?，使緊貼其邊框內(nèi)側(cè)的石蠟熔化，取出成型的組織芯片石蠟塊（見圖1E）。   1.4  組織芯片切片制作及其應(yīng)用  應(yīng)用常規(guī)病理切片技術(shù)制作組織芯片石蠟切片，根據(jù)不同的研究目的，將組織芯片石蠟切片鋪于凈潔的或經(jīng)過其他特殊處理的載玻片上（見圖2），繼續(xù)應(yīng)用于常規(guī)HE染色、免疫組織化學(xué)染色以及原位雜交等細(xì)胞學(xué)或分子生物學(xué)檢測。   2  結(jié)果   2.1  組織芯片石蠟塊  所制備的組織芯片空心蠟?zāi)?nèi)無空泡，無裂痕，陣列孔均一整齊，無變形，空心蠟?zāi)Ｖ苽溥^程

9、中無廢模出現(xiàn)，蠟?zāi)Ｖ苽涑晒β蔬_(dá)100%。所制備的組織芯片石蠟塊內(nèi)組織芯切片平面整齊，無組織芯倒浮現(xiàn)象。   2.2  組織芯片  組織芯片肉眼觀察：石蠟切片中組織芯片微組織片陣列整齊，無微組織片皺褶以及微組織片脫片現(xiàn)象。組織芯片光學(xué)顯微鏡觀察：組織芯片常規(guī)HE染色后，經(jīng)病理診斷醫(yī)生閱片，并與各組織芯原供體石蠟標(biāo)本常規(guī)病理HE染色片進(jìn)行對照觀察，病理診斷結(jié)果一致。表明所制作的組織芯片取材的準(zhǔn)確性高，能滿足進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究需要。   3  討論   1986年Battifora首先在Lab Invest發(fā)表文

10、章，創(chuàng)立了組織芯片的雛形。1998年，Kononen等1首先提出了組織芯片（Tissue microarrays）的概念，即將數(shù)十個甚至數(shù)千個不同個體的組織標(biāo)本集成在一張固相載體上形成組織微陣列生物芯片，此項(xiàng)研究突破了單一的腫瘤基因芯片表達(dá)譜研究模式，開始結(jié)合細(xì)胞和組織水平的高通量技術(shù)。醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)研究領(lǐng)域于是有了一種新的高通量、大樣本的快速分析工具。組織芯片將眾多樣本放在同一切片上，同化了實(shí)驗(yàn)條件，減少了因普通實(shí)驗(yàn)方法中分批、分次實(shí)驗(yàn)造成的實(shí)驗(yàn)誤差，節(jié)約了實(shí)驗(yàn)試劑和時間。根據(jù)不同的需要可設(shè)計單一腫瘤組織芯片、多腫瘤組織芯片、腫瘤進(jìn)展組織芯片、腫瘤預(yù)后組織芯片等等不同類型的組織芯片。組織芯片

11、結(jié)合傳統(tǒng)病理學(xué)技術(shù)、免疫組織化學(xué)以及原位雜交等分子生物學(xué)技術(shù)9，10，廣泛地運(yùn)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域，為基因功能研究走向臨床提供了捷徑。   組織芯片技術(shù)有省時、省力、低成本、高通量、大樣本等許多優(yōu)點(diǎn)，但實(shí)際制作組織芯片的過程中仍有許多有待改進(jìn)之處，為此，研究者對組織芯片制備技術(shù)進(jìn)行了不懈的探索和研究。本研究針對組織芯片制作過程中存在的缺陷，自行研制了組織芯片空心蠟?zāi)Ｒ淮涡猿尚湍＞撸M織芯片制作技術(shù)進(jìn)行改良，取得了良好的效果。   關(guān)于石蠟的選擇。石蠟黏稠度高、韌性強(qiáng)，常規(guī)打孔時不易斷裂，但拔除組織芯片陣列管針時阻力大，陣列管針不易拔除。反之，則容易將

12、實(shí)心空白蠟?zāi)４蛄?，產(chǎn)生廢模11，12。應(yīng)用組織芯片空心蠟?zāi)Ｒ淮涡猿尚湍＞咧苽淇招南災(zāi)?，無需先制備組織芯片實(shí)心空白蠟?zāi)Ｔ龠M(jìn)行打孔處理，有效避免了上述因蠟?zāi)４蚩撞僮饕鸬南盗袉栴}，使用不同熔點(diǎn)不同黏稠度的石蠟，均可順利制備完好的空心蠟?zāi)?，成品合格率達(dá)100%。             關(guān)于二次石蠟包埋。組織芯片石蠟塊二次包埋成功與否，直接影響到組織芯片的質(zhì)量。二次包埋成功的組織芯片石蠟塊，應(yīng)具備如下特點(diǎn)：組織芯片蠟塊中，石蠟組織芯排列整齊，無移位現(xiàn)象；石蠟組織芯處于同一切片平面，無石蠟組織

13、芯倒浮現(xiàn)象；石蠟組織芯與空心蠟?zāi)Ｈ诤狭己?，二者間不留有空隙，保證所制作的組織芯片中的微組織塊無皺褶以及脫片現(xiàn)象。采用普通灌注熔化石蠟的方法進(jìn)行二次包埋13，熔化的石蠟很難有效灌注到石蠟組織芯與空心蠟?zāi)？妆陂g的微小間隙，主要是因?yàn)槿刍氖灲佑|到處于室溫的蠟?zāi)r，往往未進(jìn)入到石蠟組織芯與空心蠟?zāi)？妆陂g的微小間隙就已開始凝固，致使二次石蠟包埋有名無實(shí)。將熔化石蠟的溫度調(diào)高到足以能順利進(jìn)入石蠟組織芯與空心蠟?zāi)？妆陂g的微小間隙的溫度，則熔化的石蠟即會將組織芯片石蠟塊整體熔化，致使組織芯片石蠟塊毀損。于是研究者研制出組織芯片二次包埋儀14，采用熔化石蠟灌注同時進(jìn)行負(fù)壓抽吸的方法進(jìn)行二次石蠟包埋。當(dāng)石蠟組

14、織芯與空心蠟?zāi)ｉg的間隙較大時，適當(dāng)調(diào)整熔化石蠟的溫度和負(fù)壓壓力，采用該方法能取得較好的二次包埋效果；而當(dāng)石蠟組織芯與空心蠟?zāi)ｉg的間隙較小時，負(fù)壓吸引的作用極其有限，難以獲得良好的二次包埋效果。另有研究者建議將裝滿石蠟組織芯的組織芯片石蠟塊整體放入烤箱中逐漸緩慢升溫處理，使石蠟組織芯與組織芯片蠟?zāi)Ｈ诤?，達(dá)到二次包埋的目的11,13,15。其不足之處是溫度和時間較難控制，費(fèi)時、費(fèi)力，二次包埋效果亦不盡人意。   本研究將裝滿石蠟組織芯的組織芯片石蠟塊整體放入維持加溫的少量熔化石蠟中，直接將石蠟組織芯與組織芯片蠟?zāi)＿M(jìn)行融合處理，取得了滿意的效果，而且實(shí)際操作過程簡單，容易掌握控制

15、。需要引起注意的是組織柱點(diǎn)樣完畢，一定要將組織柱逐一輕輕壓下，使其處于同一切片平面；二次石蠟包埋前，一定要進(jìn)行簡單的組織柱防脫處理，以免在將裝滿石蠟組織芯的組織芯片石蠟塊整體轉(zhuǎn)入熔蠟盤中時，部分組織柱脫落。二次石蠟包埋時，同時將組織芯片石蠟塊與塑料包埋盒一同固定，有利于組織芯片蠟塊標(biāo)記，并有利于常規(guī)石蠟切片時能將組織芯片石蠟塊直接固定到石蠟切片機(jī)上，便于切片?？傊?，本改良的石蠟組織芯片制備技術(shù)無需應(yīng)用負(fù)壓吸引等特殊儀器設(shè)備，技術(shù)簡單易學(xué)，操作流程容易掌握控制，有利于組織芯片技術(shù)的普及和推廣應(yīng)用。【參考文獻(xiàn)】  1 Kononen J, Bubendorf L, Kallioniemi

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