單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂對豚鼠膽紅素神經(jīng)毒性的影響

1、單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂對豚鼠膽紅素神經(jīng)毒性的影響        【摘要】     目的 觀察單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂 (簡稱GM1) 對豚鼠膽紅素神經(jīng)毒性的影響。方法 在制作膽紅素腦病動物模型基礎(chǔ)上予GM1干預(yù)，觀察對照組、模型組、干預(yù)組新生豚鼠（每組12只）干預(yù)后4、8h的腦組織ATP含量與含水量、腦組織超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果 模型組與干預(yù)組腦組織ATP含量（4、8h）明顯低于對照組（0.05)，且干預(yù)組與模型組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.05)；模型組腦組織含水量在干

2、預(yù)后8h顯著增高(0.05)，GM1干預(yù)治療可顯著減輕膽紅素毒性腦水腫(0.05)；腦組織超微結(jié)構(gòu)變化與之相符。結(jié)論 沉積于腦組織膽紅素可抑制神經(jīng)元能量代謝，致腦細(xì)胞水腫；GM1可影響能量代謝變化，減輕腦水腫，對膽紅素神經(jīng)毒性具有治療作用。     【關(guān)鍵詞】  單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂；腺苷三磷酸；膽紅素腦病    基金項(xiàng)目：2004年度湛江市科技攻關(guān)項(xiàng)目（湛科200488號）    Effect of GM1 on bilirubin neurotoxicityZHONG

3、 Jubin, AO Dang, ZHENG Xiaoqing, WANG Xuguang3, JIE Xinming1. Department of Pediatrics，the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College， Zhanjiang 524001, China        Abstract: Objective  To observe the effect of GM1 on the neurotoxicity of bilirubin. Methods&

4、#160; Thirtysix guinea pigs were randomly divided into control, model and treatment groups, and the bilirubin encephalopathic model was established only in the latter two groups, followed by intraperitoneal injection of normal saline and GM1 (10mg/kg), respectively. The brain ATP level, water conten

5、t and ultrastructure were measured at 4 and 8 hours.Results  The brain ATP production in guinea pigs decreased within 4 hours after exposure to bilirubin, especially in model group (0.05). The water content in model group was superior to that in treatment and control groups at 8 hours (0.05). T

6、he improvement of neuronal and mitochondrial swelling was seen in treatment group at 8 hours as compared with model group.Conclusion  Bilirubin deposition in the brain could result in the brain edema via the inhibition of energy metabolism. GM1 is effective in the treatment of bilirubin encepha

7、lopathy by way of the improvement of energy metabolism and brain edema.    Key words: GM1; ATP; bilirubin encephalopathy新生兒高膽紅素血癥是新生兒時期常見病癥，并發(fā)膽紅素腦病可致新生兒死亡，幸存者常遺留腦性癱瘓、智力低下及呼力障礙等嚴(yán)重后遺癥。因此，合理科學(xué)地防治膽紅素腦病對于優(yōu)生優(yōu)育具有重要的意義。單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂 (簡稱GM1)目前已廣泛應(yīng)用于多種神經(jīng)系統(tǒng)疾患的治療，但其是否對膽紅素腦病具有治療作用目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本文目的是觀察

8、探討GM1對膽紅素腦病是否具有治療作用，為臨床應(yīng)用GM1治療膽紅素腦病提供理論依據(jù)。1  資料與方法1.1  實(shí)驗(yàn)動物    生后57d豚鼠，重4050g，雌雄不拘，購自廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，共36只，隨機(jī)分為3組：對照組、模型組、干預(yù)組，每組12只。    1.2  模型制作    避光稱取晶體膽紅素（Sigma公司）20mg溶于1 mL 0.5mol/L NaOH中，加入雙蒸水9mL，用0.5mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至8.5，配制膽紅素溶液；對照組豚鼠腹腔給予生理鹽

9、水0.5mL，模型組與干預(yù)組豚鼠腹腔給予膽紅素200g/g。    1.3  干預(yù)程序    造模后4h，給予對照組和模型組豚鼠腹腔注射生理鹽水各0.5mL，干預(yù)組豚鼠腹腔注射GM1鈉鹽注射液 10mg/kg。    1.4  療效觀察指標(biāo)    干預(yù)治療后，對照組、模型組和干預(yù)組豚鼠分別于干預(yù)后4、8h斷頭取腦，進(jìn)行下列指標(biāo)測定：豚鼠斷頭取腦，于皮層及腦干區(qū)域距正中1mm處兩側(cè)分別取腦組織共4塊作病理切片，其余腦組織沿正中切開：一側(cè)腦組織稱重后置丙酮中漂

10、洗，TrisHCl緩沖液中搗碎，離心抽提上清液加入熒光素酶熒光素復(fù)合物（上海振生公司產(chǎn)品），用FG300型發(fā)光光度計(jì)測熒光強(qiáng)度，按標(biāo)準(zhǔn)曲線換算樣本ATP含量3。采用干濕法。上述另一側(cè)腦組織稱重后置80烤箱烘干至恒重，按（濕重-干重）/濕重×100%計(jì)算腦組織含水量。上述4塊腦組織，同側(cè)兩塊立即冰凍切片，光鏡下觀察膽紅素沉積情況；對側(cè)兩塊置于戊二醛溶液中，乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，電鏡下觀察腦組織超微結(jié)構(gòu)變化情況。    1.5  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理    結(jié)果以xTX-±s表示，采用單因素方差分析及q

11、檢驗(yàn)。    2  結(jié)果2.1  腦組織ATP含量測定    模型組腦組織ATP含量在干預(yù)后4、8h均顯著低于對照組(0.05)；GM1干預(yù)組腦組織ATP含量亦顯著低于對照組(0.05)，但比模型組有一定程度的增高 (0.05)，見表1。表1  各組豚鼠干預(yù)后不同時間腦組織ATP含量測定（略）    2.2  腦組織含水量測定    模型組腦組織含水量在干預(yù)后8h顯著增高(0.05)；GM1干預(yù)治療可顯著減輕膽紅素毒性腦水腫(0.05)

12、，見表2。表2  各組豚鼠干預(yù)后不同時間腦組織含水量測定（略）    2.3  腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察GM1干預(yù)后8h，干預(yù)組豚鼠神經(jīng)元及其線粒體腫脹，但與同期模型模型組與干預(yù)組、對照組比較，*0.05；對照組與干預(yù)組比較均0.05。組比較明顯減輕。    3  討論    近年研究發(fā)現(xiàn)26，實(shí)驗(yàn)性膽紅素腦病腦組織ATP含量降低；神經(jīng)突觸膜Na+、K+ATP酶活力受抑制，興奮性氨基酸受體過度活化，膽紅素神經(jīng)毒性腦組織細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載。這表明膽紅素神經(jīng)毒性的發(fā)生與腦能量代謝障礙、

13、ATP儲備耗竭有關(guān)，興奮性氨基酸受體過度活化參與了膽紅素腦病的發(fā)生。早期胞內(nèi)Na+、CL、Ca2+增多，水分子內(nèi)移，細(xì)胞水腫；后期胞內(nèi)Ca2+超載，誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列Ca2+促反應(yīng)，產(chǎn)生不可逆神經(jīng)細(xì)胞損傷。針對上述膽紅素神經(jīng)毒性發(fā)生機(jī)制，最近有人探討應(yīng)用N甲基D天冬氨酸（NMDA）受體拮抗劑治療膽紅素腦病，發(fā)現(xiàn)NMDA受體拮抗劑能減輕膽紅素神經(jīng)毒性引起的繼發(fā)性腦水腫3，并能拮抗膽紅素毒性腦組織細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載。但NMDA受體拮抗劑，如NMDA不加選擇地抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，其中包括正常神經(jīng)功能，同時減弱了腦損傷后的可塑性反應(yīng)，抑制了腦神經(jīng)發(fā)育和修復(fù)，這就限制了NMDA受體拮抗劑在臨床上應(yīng)用。&

14、#160;   神經(jīng)節(jié)苷脂是一類含有唾液酸的膜糖脂的總稱，至今研究最多的是GM1。既往研究表明，GM1可通過多種機(jī)制來對抗各種原因所致的腦組織損傷78：（1）對抗興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用。GM1有別于競爭性或非競爭性NMDA受體拮抗劑，它只選擇性地阻滯NMDA受體的病理性興奮，而不影響該受體對興奮性氨基酸正常生理反應(yīng)的信號傳遞；（2）防止細(xì)胞內(nèi)Ca2+積聚，減輕腦水腫；（3）維持神經(jīng)細(xì)胞膜Na+，K+ATP酶的活性，減少神經(jīng)細(xì)胞膜脂肪酸丟失，防止ATP動力學(xué)特性改變；（4）增加缺血腦組織超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶活性，提高缺氧缺血腦組織對氧自

15、由基的清除能力。GM1易于通過血腦屏障，調(diào)節(jié)膜介導(dǎo)的細(xì)胞功能，在細(xì)胞分化和發(fā)育、神經(jīng)元修復(fù)和再生等方面起著重要作用。    外源性GM1已廣泛應(yīng)用于多種神經(jīng)系統(tǒng)疾患的治療，但其是否對膽紅素腦病具有治療作用，目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。為進(jìn)一步明確GM1是否對膽紅素腦病具有治療作用，我們觀察了神經(jīng)節(jié)苷脂GM1對膽紅素神經(jīng)毒性的影響。結(jié)果顯示：膽紅素腦病模型組與干預(yù)組腦組織ATP含量均顯著低于對照組(0.05)，且干預(yù)組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.05)。上述結(jié)果表明：膽紅素沉積于腦組織可抑制神經(jīng)元能量代謝，而GM1可影響這種毒性作用。此外，本文結(jié)果還顯示：膽紅素腦病

16、模型組腦組織含水量在干預(yù)后8h顯著高于對照組(0.05)；干預(yù)組腦組織含水量在干預(yù)后8h與模型組比較明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.05)，且腦組織超微結(jié)構(gòu)變化與此相符；而干預(yù)后4h腦組織含水量變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明：膽紅素可致腦細(xì)胞水腫，且腦組織含水量變化落后于腦組織能量代謝變化，GM1可減輕腦水腫。    綜上所述，我們認(rèn)為：沉積于腦組織的膽紅毒可抑制神經(jīng)元能量代謝，繼而導(dǎo)致腦細(xì)胞水腫；GM1對膽紅素神經(jīng)毒性的影響在于抑制神經(jīng)元能量代謝和減輕腦水腫，對膽紅素神經(jīng)毒性具有治療作用。    【參考文獻(xiàn)】  1俞惠民，洪文瀾.新生兒高間接膽紅素血癥患兒遠(yuǎn)期隨訪觀察J.中華兒科雜志,1996,34(5):324326.2陳舜年，賁曉明，李佩紅,等. 膽紅素腦病動物模型制作與鑒定J.新生兒科雜志，1997,12(4):166169.3賁曉明, 陳舜年，秦玉明,等.興奮性氨基酸受體拮抗劑對膽紅素神經(jīng)毒性的影響J.中華兒科雜志,2000,38(3):144146.4田巧紅，徐天鶴，華子瑜.膽紅素腦病發(fā)病機(jī)制及防治研究進(jìn)展J.世界今日醫(yī)學(xué)雜志，2002,3(7):659661.5楊光