醫(yī)學(xué)生化儀器分析095SDSPAGE課件

1、蛋白質(zhì)樣品在蛋白質(zhì)樣品在100100用用SDSSDS和還原劑處理和還原劑處理3-5mins3-5mins后解聚成亞基后解聚成亞基 膠束在膠束在SDS-PAGESDS-PAGE系統(tǒng)中的電泳遷移率不再系統(tǒng)中的電泳遷移率不再受蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒受蛋白質(zhì)原有電荷的影響，而主要取決于橢圓棒的長軸長度，即蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。的長軸長度，即蛋白質(zhì)或亞基分子量的大小。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在1515KD200KDKD200KD之間時，之間時，電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系電泳遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系凝膠濃度凝膠濃度T（C=2.6） 分子質(zhì)量范圍分子質(zhì)量范圍（

2、kDa） 凝膠濃度凝膠濃度T（C=5） 分子質(zhì)量范圍分子質(zhì)量范圍（kDa） 5 5101015152020 25-20010-70 50405 5101015152020 60-17020-10010- 50 5 - 40標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量未未知知蛋蛋白白在一定的凝膠濃度下，在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對數(shù)與多肽鏈分子量的對數(shù)與多肽鏈的相對遷移率成多肽鏈的相對遷移率成線性關(guān)系，所以可以通線性關(guān)系，所以可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽過標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽鏈分子量鏈分子量。 相對遷移率相對遷移率= = 蛋蛋白白樣樣品品距距加加樣樣端端遷遷移移距距離離c cm m溴溴酚酚藍(lán)藍(lán)區(qū)區(qū)帶帶中中心

3、心距距加加樣樣端端距距離離c cm m 相相對對遷遷移移率率每個蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對數(shù)對它的相對遷移率作圖得每個蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對數(shù)對它的相對遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測出其分于量，標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測出其分于量，這樣的標(biāo)難曲線只對同一塊凝膠上的樣品的分子量測這樣的標(biāo)難曲線只對同一塊凝膠上的樣品的分子量測定才具有可靠性。定才具有可靠性。 貯液貯液 凝膠濃度凝膠濃度(c=2.6(c=2.6) )單體貯液（單體貯液（mLmL）緩沖液貯液（緩沖液貯液（mLmL）雙蒸水（雙蒸水（mLmL）1010過硫酸銨（過硫酸銨（uLuL）TEMED TEMED （uLuL）5.3

4、 10.04.5100100T=5.1 6.710.03.11001009.010.0 0.8100100T=10.2 T=7.7 丙稀酰胺單體貯液丙稀酰胺單體貯液 14 1455g55g丙稀酰胺丙稀酰胺0.45g N,N-0.45g N,N-甲叉雙丙稀酰胺，先用甲叉雙丙稀酰胺，先用 35ml 35ml雙蒸水溶解，攪拌，直到溶液變成透明，再用雙蒸雙蒸水溶解，攪拌，直到溶液變成透明，再用雙蒸 水稀釋到水稀釋到50ml50ml，過濾。用棕色瓶可在，過濾。用棕色瓶可在44保存一個月。丙保存一個月。丙 稀酰胺和甲叉雙丙稀酰胺單體及溶液是中樞神經(jīng)毒物，稀酰胺和甲叉雙丙稀酰胺單體及溶液是中樞神經(jīng)毒物， 要

5、小心操作。要小心操作。 濃縮膠緩沖液貯液濃縮膠緩沖液貯液（1mol/L Tris1mol/L TrisHCL,PH6.8HCL,PH6.8） 6.06gTris 6.06gTris溶解在溶解在40ml40ml雙蒸水中，用雙蒸水中，用4mol/L4mol/L鹽酸調(diào)至鹽酸調(diào)至 PH6.8 PH6.8。再用雙蒸水稀釋至。再用雙蒸水稀釋至50ml50ml，保存在，保存在44備用。備用。 分離膠緩沖液貯液分離膠緩沖液貯液（1.5mol/L Tris1.5mol/L TrisHCL,PH8.8HCL,PH8.8） 9.8gTris 9.8gTris溶解在溶解在40ml40ml雙蒸水中，用雙蒸水中，用4mo

6、l/L4mol/L鹽酸調(diào)至鹽酸調(diào)至 PH8.8 PH8.8。再用雙蒸水稀釋至。再用雙蒸水稀釋至50ml50ml，保存在，保存在44備用。備用。 貯液貯液 凝膠終濃度凝膠終濃度單體貯液（單體貯液（mLmL）濃縮膠緩沖液貯液（濃縮膠緩沖液貯液（mLmL）分離膠緩沖液貯液（分離膠緩沖液貯液（mLmL）雙蒸水（雙蒸水（mLmL）1010過硫酸銨（過硫酸銨（uLuL）TEMED TEMED （uLuL）3.4 2.4-0.2141010 T=3 T=5 5-7.50.317.21010T=10 10-7.50.312.21010T=15 T=20 15- 7.50.37.21010 20-7.50.32

7、.21010 注：過硫酸銨應(yīng)在灌膠前加。注：過硫酸銨應(yīng)在灌膠前加。 過硫酸銨和過硫酸銨和TEMEDTEMED的量應(yīng)根據(jù)室溫情況或聚的量應(yīng)根據(jù)室溫情況或聚 合情況而定。合情況而定。 應(yīng)配制不同終濃度，不同厚度或不同大小應(yīng)配制不同終濃度，不同厚度或不同大小 的凝膠，可根據(jù)表中的體積按比例變化。的凝膠，可根據(jù)表中的體積按比例變化。 貯液貯液 凝膠終濃度凝膠終濃度單體貯液（單體貯液（mLmL）濃縮膠緩沖液貯液（濃縮膠緩沖液貯液（mLmL）分離膠緩沖液貯液（分離膠緩沖液貯液（mLmL）甘油（甘油（mlml）雙蒸水（雙蒸水（mLmL）1010過硫酸銨（過硫酸銨（uLuL）TEMED TEMED （uLuL

8、）3.4 2.4-1.00.2141010 T=3 T=5 5-7.50.30.317.21010T=10 10-7.50.30.312.21010T=15 T=20 15- 7.50.30.37.21010 20-7.50.30.32.21010 Separating gel固定固定試劑試劑 時間時間 500ml500ml乙醇乙醇100ml100ml冰醋酸冰醋酸400ml400ml蒸餾水蒸餾水. .浸泡浸泡75ml75ml乙醇乙醇17g17g醋酸鈉醋酸鈉1.25ml251.25ml25戊二醛戊二醛0.5g0.5g硫代硫酸鈉硫代硫酸鈉.5H.5H2 2O O用用ddddH2O溶解后加至溶解后加

9、至250ml30mins30mins步驟步驟至少至少30mins30mins漂洗漂洗用蒸餾水漂洗用蒸餾水漂洗3 3次次5mins/5mins/次次銀染銀染試劑試劑 時間時間 0.25g0.25g硝酸銀硝酸銀50ul50ul甲醛甲醛用用ddHddH2 2O O溶解后溶解后加至加至250ml250ml顯色顯色6.25g6.25g碳酸鈉碳酸鈉25ul25ul甲醛甲醛用用ddH2O加至加至250ml2-10mins2-10mins視蛋白視蛋白帶顯示深棕色帶顯示深棕色步驟步驟20mins20mins終止終止3.65gEDTA-Na3.65gEDTA-Na2 2.2.2H2O用蒸餾水加至用蒸餾水加至250

10、ml250ml10mins10mins漂洗漂洗保存保存用蒸餾水漂洗用蒸餾水漂洗3 3次次5mins/次次250250甘油用水加至甘油用水加至250ml250ml30mins取出晾干取出晾干由丁香園版主翻譯總結(jié) 涂抹痕跡可能由于多種原因引起，但是最常見的原因是聚丙烯酰胺凝膠倒膠的不均勻或者上樣量過大。這塊膠倒膠不正確，在上部膠倒入制膠槽之前就已經(jīng)發(fā)生聚合。首先倒入的膠聚合發(fā)生的太快了。與其重新倒膠，不如停止倒膠重新準(zhǔn)備新的聚丙烯酰胺混合液，然后將新的膠倒入舊膠的上方。但是顯然這種連接不是非常牢固。（我推薦重新倒膠，制膠很關(guān)鍵，如果你后續(xù)還要做blot，膠沒有跑好浪費太多了?。?條紋拖尾條紋拖尾例

11、例1 1條帶過淺條帶過淺- -例例1 1過早終止電泳過早終止電泳例例1 1 扭曲的條帶扭曲的條帶Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 醫(yī)學(xué)生化儀器分析095SDSPAGEBioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 醫(yī)學(xué)生化儀器分析095SDSPAGEBioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 醫(yī)學(xué)生化儀器分析095SDSPAGEBioinformatics, 2010-201

12、1, Shanxi Agricultural University 醫(yī)學(xué)生化儀器分析095SDSPAGESDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） 使用含有十二烷基硫酸鈉（使用含有十二烷基硫酸鈉（ SDS）和還原劑（通常為）和還原劑（通常為巰基乙醇）的樣品處理液對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行處理（一般煮巰基乙醇）的樣品處理液對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行處理（一般煮沸沸35分鐘），通過加熱和分鐘），通過加熱和SDS可以使蛋白質(zhì)變性，多亞可以使蛋白質(zhì)變性，多亞基的蛋白質(zhì)也將解離為單亞基。同時還原劑可以切斷蛋白基的蛋白質(zhì)也將解離為單亞基。同時還原劑可以切斷蛋白質(zhì)中的二硫鍵（使二硫鍵還原）。質(zhì)中的二硫鍵

13、（使二硫鍵還原）。 經(jīng)過這樣處理的樣品中的肽鏈都是處于無二硫鍵連接經(jīng)過這樣處理的樣品中的肽鏈都是處于無二硫鍵連接的，分離的狀態(tài)。由于的，分離的狀態(tài)。由于SDS是帶有負(fù)電荷的分子，同時它是帶有負(fù)電荷的分子，同時它有一個長的疏水尾巴，有一個長的疏水尾巴，SDS通過疏水尾巴與肽鏈中的氨基通過疏水尾巴與肽鏈中的氨基酸的疏水側(cè)鏈結(jié)合，結(jié)合酸的疏水側(cè)鏈結(jié)合，結(jié)合SDS的比率大約是一個蛋白質(zhì)分的比率大約是一個蛋白質(zhì)分子中每兩個氨基酸殘基結(jié)合一分子的子中每兩個氨基酸殘基結(jié)合一分子的SDS。Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 醫(yī)學(xué)生

14、化儀器分析095SDSPAGE 垂直板垂直板電泳裝置電泳裝置加樣加樣樣品遷樣品遷移方向移方向Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 醫(yī)學(xué)生化儀器分析095SDSPAGE電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分電泳過程中分子遷移的規(guī)律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒。子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒?；旌蠘悠坊旌蠘悠穾Э啄z帶孔膠 按分子按分子大小分離大小分離電泳方向電泳方向 電泳電泳 小分子小分子大分子大分子Bioinformatics, 2010-2011, Sh

15、anxi Agricultural University 醫(yī)學(xué)生化儀器分析095SDSPAGE標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量未未知知蛋蛋白白在一定的凝膠濃度下，在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對數(shù)與多肽鏈分子量的對數(shù)與多肽鏈的相對遷移率成多肽鏈的相對遷移率成線性關(guān)系，所以可以通線性關(guān)系，所以可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽過標(biāo)準(zhǔn)曲線求未知多肽鏈分子量鏈分子量。 相對遷移率相對遷移率Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 醫(yī)學(xué)生化儀器分析095SDSPAGE水平式電泳裝置水平式電泳裝置電泳緩沖液電泳緩沖液凝膠凝膠Bioinfo

16、rmatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 醫(yī)學(xué)生化儀器分析095SDSPAGE單體：丙烯酰胺（單體：丙烯酰胺（AcrAcr）；）；交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（BisBis）；）；催化劑：過硫酸胺或核黃素；催化劑：過硫酸胺或核黃素；加速劑：四甲基乙二胺（加速劑：四甲基乙二胺（TEMEDTEMED）；）；產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。產(chǎn)物：三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。聚丙烯酰胺凝膠（聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel, PAG）的聚合反應(yīng)：的聚合反應(yīng)：Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi

17、 Agricultural University 醫(yī)學(xué)生化儀器分析095SDSPAGEBioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 醫(yī)學(xué)生化儀器分析095SDSPAGE分離膠分離膠( (10% 10ml10% 10ml) )濃縮膠濃縮膠(5% 10ml)(5% 10ml)ddHddH2 2O O4.05ml4.05ml6.8ml6.8ml30%Acr30%Acr3.3ml3.3ml1.7ml1.7mlBufferBuffer1.5mol/L pH=8.8 1.5mol/L pH=8.8 Tris-HCl 2.5mlTris-

18、HCl 2.5ml0.5mol/L pH=6.8 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 1.25mlTris-HCl 1.25ml10%SDS10%SDS100100l l100100l l10%Ap10%Ap5050l l100100l lTEMEDTEMED1010l l1010l l 配配 膠膠 Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 醫(yī)學(xué)生化儀器分析095SDSPAGEBioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 醫(yī)學(xué)生化儀器分析

19、095SDSPAGEBioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 醫(yī)學(xué)生化儀器分析095SDSPAGEBioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 醫(yī)學(xué)生化儀器分析095SDSPAGEBioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 醫(yī)學(xué)生化儀器分析095SDSPAGE按下式計算相對遷移率： 每個蛋白標(biāo)準(zhǔn)的分子量對數(shù)對它的相對遷移率作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測出其分于量，這樣的標(biāo)難曲線只對同一塊凝膠上的樣品的分子量測定才具有可靠性= 蛋白樣品距加樣端遷移距離cm溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離cm 相對遷移率Bioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 醫(yī)學(xué)生化儀器分析095SDSPAGEBioinformatics, 2010-2011, Shanxi Agricultural University 醫(yī)學(xué)生化儀器分析095SDSPAGEBioinformatics, 2010-201